巨细胞病毒感染、包涵体形成与生精细胞凋亡及不育症
文章导读:本文就巨细胞病毒感染的病原学、流行病学、传播途径、发病机制、细胞病变效应和包涵体侵入细胞过程进行了介绍。对血管内皮细胞脂质体的形成,多发性骨髓瘤浆细胞内包涵体类型,精液中生精细胞内检出的6种包涵体类型和形态特征进行了描述。由病毒感染对精子运动的影响和生精细胞凋亡与男性不育,进行报道。 |
巨细胞病毒(Cytomegalo-virus, CMV)引起全身性感染综合征。被感染细胞变大,核内和胞浆内形成包涵体,故又称巨细胞包涵体病(Cytomegalic inclusion disease,CID),可引起胎儿先天性畸形外,儿童和成人可累及多脏器损伤。本文就人巨细胞病毒(HCMV)感染、包涵体形成与特征、生精细胞感染、凋亡及不育症综述如下。
1 病原学、流行病学、传播途径
CMV是最大的一种病毒,直径约200nm,电镜显示有64nm的核心,外包110nm衣壳,排列成20面体,衣壳外有一无定形的被膜。CMV基因组由一条线状双链长56~76nm的DNA组成。一个血清型,三个亚型。
CMV感染在全世界分布,呈世界流行,人是 CMV唯一宿主。美国约1%新生儿感染,马来西亚学龄前儿童96% CMV抗体阳性。美国和西欧青年妇女血清阳性率为50%~90%。上海的产妇感染率为92%,沈阳达99%。
崔应琦对1202例早孕妇女调查:孕妇血清HCMV-IgM抗体与其坯胎抗原的发布频数呈密切的一致性(χ2=5.15,P<0.05),说明胎儿从母体获先天感染。
Kapranos等报道在113例男性患者的精液中病毒检出率为56.6%。李哲等报道在469例男性不育精液中,阳性率8.32%。吴坤河报道在精液中CMV检出率为10.10%(10/99)。说明精液中存在 CMV病毒感染。
隐性感染或局部感染者,病毒存在乳汁、唾液、粪、尿、分泌物和精液中,无症状患者会长期或间歇地排毒数月至数年,成为巨细胞病毒(CMV)带菌者。
CMV可在孕产期传播给胎儿,分娩时经产道和哺乳传播。成年人可经性行为传播。精液及阴道分泌物中含有CMV无症状的携带者很常见,在妓女和同性恋患者中,CMV抗体100%阳性。特别通过“四口循环”性行为模式,易造成CMV的传播,乒乓效应起到推波助澜作用。
隐性CMV感染的激发,也常发生在器官移植、白血病、淋巴瘤等患者中,长期坚持免疫治疗,机体免疫力降低,致体内潜伏的CMV被激活,引起发病。
2 发病机制
初感染后,CMV在宿主的细胞内无限期存在。人感染CMV后,如果宿主的T细胞功能受损,潜伏的病毒就可能发生复活并引起多种综合征,并引起免疫功能降低,特别是细胞免疫功能降低。 CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些未确定的单核细胞中复制,其中以单核吞噬细胞最易感染,另淋巴细胞的多种免疫功能受损。精液生精细胞检测中,检出吞噬细胞明显增加者,提示可能是病毒感染。
总之,机体的细胞免疫功能对CMV感染的发生和发展起重要作用,细胞免疫缺陷者,可导致严重的和长期的CMV感染,并使机体的细胞免疫进一步受到抑制,发生各种各样的疾病。
3巨嗜细胞病毒感染的细胞病变效应(Cytopathogenic effect,CPE)将患者含有WBC的尿液、唾液、精液、乳汁和生殖道分泌物,接种到人成纤维母细胞(Human foreskin fibroblast,HFF)的培养物中,由于HFF是CMV的受容性细胞,可产生细胞病变效应(CPE),在接种患者体液的1天或数周,病毒可在感染细胞内复制、繁殖,经固定染色观察培养物,可见到巨噬细胞核内有包涵体,核周围有晕圈及嗜酸性胞浆内有包涵体,呈“猫头鹰眼”(owl’s eye)。具有活性CMV感染的无症状男性同性恋者精液标本的电镜照片,见精子被感染的病毒颗粒和细胞外的病毒颗粒。提示,精子和生精细胞可以被CMV病毒感染,为不育症患者的精液中检出病毒包涵体提供了依据。
4 巨嗜细胞病毒感染血管内皮细胞脂质体形成的观察
程远等报告,采用细胞病变效应,将CMV临床分离株BI-5(由美国芝加哥Rush-Presbyterina-St.Luke’s Medical Center的Nell Lurain博士惠赠),用人包皮(成)纤维细胞(Human foreskin fibroblast,HFF)进行传代培养,获第一代培养液,作为感染血管内皮细胞的病毒液。观察感染后细胞内有脂质体的形成,推测是CMV对动脉粥样硬化病变局部细胞内脂肪代谢的影响(造成)。在镜下观察到细胞内出现许多黑色颗粒,经脂肪染色黒颗粒(着色)转变为红色,从而证实这些颗粒为脂质体;在未感染的细胞中仅见散在数个脂肪染色阳性的脂质体颗粒。脂质体是由甘油三脂和胆固醇脂小滴组成,被一层薄的磷酸酯膜所包绕的小球样细胞内结构,是一种涉及多功能的细胞器,如调节脂肪代谢、参与过敏反应和机体防御,也与胆固醇的运输和合成、炎性介质的合成以及分泌调节等有关。一些病原微生物隐藏在脂质体中,以宿主细胞寄生状态,利用脂质体复制,如丙型肝炎病毒(HCV)和衣原体。CMV感染血管内皮细胞出现的脂质体增加与CMV复制有关。推测,CMV感染和病毒复制诱导宿主细胞成为动脉粥样硬化发生的种子细胞。
CMV感染血管内皮细胞CMVpp65抗原阳性:荧光显微镜下发现,BI-5感染CRL-2477细胞CMVpp65免疫阳性绿色荧光,位于细胞质和核中,可见大小不等的病毒颗粒。用相差显微镜和绿色荧光显微镜相结合,使感染细胞清晰地显示胞质中的脂质体和胞质及细胞核中的CMVpp65。磷酸蛋白pp65(ppUL83)是CMV病毒颗粒和非感染颗粒(Dense体)的主要组成成分。病毒进入细胞后,pp65随着病毒颗粒定位于细胞核。当病毒利用宿主基因组通过转录、翻译、合成组装成新的成熟有感染性的病毒时,pp65则既可以在细胞核也可以在细胞质中堆积。
5 CMV包涵体特性与检测
5.1 病毒包涵体形成过程与类型
包涵体(Inclusion body)是一些病毒感染宿主细胞后,形成的一种细胞内的特殊结构,经染色后在光镜下见在细胞浆和核内着色为嗜酸性或酸碱性颜色的圆形、针形、团块状和片状等不同特点的内含物,称之为包涵体。可在单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人乳头状病毒(HPV)、人多瘤病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和SARS病毒等疾患中出现。
病毒依赖侵蚀的宿主细胞,提供高分子合成装置才能够繁殖,病毒颗粒属于核酸和蛋白质,形成包涵体后,用光镜来检测。包涵体形成经侵入、 繁殖、收缩防守、成形等4个阶段。细胞核中间有一独立的圆形包涵体,四周被挖空,形如孤岛,由于构造特殊,与外界失去联系,因而治疗此类的病毒药物无法达到,导致药物治疗无效或效果不佳。
病毒包涵体构成:一类是由DNA构成,属于嗜碱性,HE染色时呈深蓝色,位于细胞核内,包涵体的四周为空白区。合胞病毒和巨细胞病毒包涵体主要是由DNA构成;另一类病毒包涵体由RNA构成呈嗜酸性,位于细胞浆中,在HE染色时包涵体呈淡粉红色,SARS病毒包涵体属于这一类。为什么有寄居核内及浆内有选择性,尚不清楚。
5.2 尿中包涵体的检出
包涵体的检查:早期作晨尿活体染色和干片染色检查,检出上皮细胞内包涵体可作为病毒感染诊断的标记(Mark)延用已久。可用瑞特染色(Wright’s satin)或姬氏染色(Gieamsa’s stain),或用瑞-姬染色鉴定核内及浆内包涵体。
形态学:尿中的病毒感染的上皮细胞增大直径可达20~70μm,细胞浆瑞特染色呈粉色或淡粉色,细胞核膜增厚呈单核或双核,核周围有光环(halo)形成,可以看到核内和浆内有猫头鹰眼状包涵体。另外可以见到小型核浓染,核染色质(Chromatin)结构不清的细胞散在,核膜增厚呈磨(毛)玻璃状,还可以看到细胞浆内嗜碱性颗粒的包涵体,这两种包涵体经细胞化学染色脱氧核糖核酸(feulgen’s反应)阳性,表示含有DNA,细胞浆内包涵体PAS(过碘酸-雪夫染色)染色呈阳性,说明含有多糖类神经氨酸(Neuramin acid)。
CMV患者宫颈或尿中排出病毒,常为间歇性, 细胞容易发生退化, 为此,强调尿液一定要新鲜晨尿和仔细检查,可弥补尿中脱落细胞查包涵体阳性率不高的缺憾。
邵安华报告,尿沉渣检查上皮细胞内,用H-E染色,胞浆包涵体为嗜酸性,呈圆形和卵圆形,较红细胞大,直径为6~11μm,在包涵体周围有一圈白色的晕环,包涵体常常偏在胞浆的一侧。核膜与包涵体之间可形成一空白区,包涵体有时可以破裂,这是由于自身崩解所致。破碎的包涵体可以游离或聚集在分泌物中,形成颗粒样堆积。说明在分泌物中散在分布特征,我们必须在精液脱落细胞学检查中注意这一特点,残渣也有临床意义,应认真、仔细地检查,提供临床诊断依据。
5.3 包涵体在组织细胞内形态特征与骨架破坏
人类CMV 可侵犯人体多数内脏及组织。受到CMV感染的细胞可发生巨细胞改变,体积增大2 ~ 6倍,可形成核内嗜碱性包涵体及胞浆嗜酸性包涵体。H-E染色时核内型呈紫红色,胞浆型呈深蓝色,姬氏染色法核内型呈玫瑰红色,胞浆型呈深蓝色。从临床标本如尿、胃液、其他体液、活检或尸检组织中均可对CMV包涵体进行查找。
Jones等电镜下观察发现CMV感染HFF细胞时,伴有细胞骨架破坏和肌动蛋白解聚。Arcangeletti等也发现,CMV在HFF细胞中复制时,细胞微管和微丝分解,细胞骨架受损。提示肌动蛋白或微丝、微管和骨架可能是CMV感染的主要靶向,CMV攻击的是细胞骨架成分。笔者在精液中已经检出支持细胞骨架、微管、微丝,并进行了报道。
精子的前向运动主要是肌动蛋白的踏板运动,如果CMV破坏了肌动蛋白必然引起精子前向运动减弱,形成弱精子症,如果精子肌动蛋白被严重破坏,有可能出现不动精子(死精子),这一点应该引起临床注意,特别“死精子”状态,应考虑病毒感染的可能性。
5.4 多发性骨髓瘤浆细胞内包涵体类型
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。根据史敏报告可见6种细胞内形态不同的包涵体。笔者在精液脱落细胞中,看到了形态各异的包涵体。
6 病毒感染引起的男性不育
6.1 病毒感染对白细胞精子症与精子凋亡、运动的影响
Kapranos发现单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)会在精子氧化损伤早期发挥作用。4%~50%不育男性精液中可发现Ⅱ型DNA及特异性IgM抗体,同时WBC数目可升高10倍。人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性精液中,最明显的特征是WBC显著增多,WBC诱导ROS影响精子,损伤精子运动。临床上发现白细胞精子症(一定以染色确定WBC)的患者,应进一步检查病毒感染的可能性。
熊锦文等用鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus, MCMV)感染小鼠,观察对小鼠精子凋亡的影响,证明了生殖器官MCMV急性感染可诱导附睾尾成熟精子的凋亡;精子线粒体主动参与并调控了精子的凋亡过程。研究表明,各种生理病理刺激如氧应激、细胞内钙超载、病原微生物感染均可造成线粒体的损伤,造成精子运动功能障碍。MCMV急性感染的早期,细胞可能对感染产生应激反应,精子线粒体能量代谢反应性活跃,因而线粒体△ψm(线粒体跨膜电位值)增高;随后,MCMV感染影响线粒体的功能开始显现,这是由于MCMV寄居细胞内的状态影响精子线粒体功能,导致线粒体的功能紊乱,尤其是线粒体△ψm的下降是发生凋亡的重要环节。一旦线粒体△ψm耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程。为此,线粒体的功能下降,是导致细胞损伤的重要因素。
6.2 病毒感染对睾丸的损伤与生精细胞的影响
Chevalier等报告人巨细胞病毒(HCMV)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ) 被感染的生精细胞出现为凋亡等病理性改变。吴坤河等采用PCR和免疫细胞化学法(ICC),对精液中生精细胞被HCMV和HSV-Ⅱ感染观察。阳性病例中,均显较多未成熟生精细胞,均出现凋亡现象,但未见病毒包涵体。病毒阳性组精子密度明显低于阴性组(P<0.05)。如不育者精液发现大量生精细胞脱落时,建议进行HCMV检测。
病毒感染导致男性不育的机制的探讨中,有学者认为病毒可能感染生精细胞,并在细胞内增殖,使睾丸精子生成功能障碍,可能是不育的原因之一。熊锦文等实验研究结果,MCMV感染小鼠睾丸后,生精小管内各级生精细胞排列紊乱,空泡变性甚至无精子生成;间质细胞增生并可见嗜碱性病毒包涵体,生精细胞内未找到病毒包涵体;睾丸病变均表现局灶性、正常组织与病变部位同时存在于同一张切片中,表明病毒感染并不造成睾丸功能的完全丧失。这一点证明积极治疗挽救睾丸功能的可能性。熊锦文等报道用 MCMV接种小鼠,原位杂交(in stitu hybridization ,ISH)结果显示小鼠间质细胞和/或各级生精细胞胞质见棕黄色颗粒阳性着色,提示MCMV可感染睾丸组织内各级细胞主要是间质细胞。
周增娣等报告精子凋亡与男性生殖障碍有着十分密切的关系,精子凋亡可能是引发特发性少精、弱精、畸形精子症的分子原因。
6.3 精液中生精细胞内包涵体的检出
将腮腺炎患者精液中检出的包涵体形态介绍及进行分型。大多为细胞质内包涵体,一般在一个以上,呈圆形、椭圆形、棒状、点状和针状等多种多样。瑞-姬染色可见两种颜色“嗜酸性细胞包涵体(Intra-Cyophsmic Eosinophilic bodies)”和“嗜碱性细胞质包涵体(Intra-Cyophsmic Basophilic bodies)”。经巴氏染色呈棕褐色,乍看呈透明蛋白状,瑞-姬染色呈蓝色。与病毒感染的关系和交叉感染等问题,尚需进一步探讨。初步检出、分类和判定如下:
6.3.1 脂质型包涵体病毒在生精细胞的胞质内形成包涵体。瑞-姬染色为浅红色或浅蓝色(脂质体多为嗜酸性,尿中也可以检出),圆形或椭圆形,一般可见1或2个团块状,大小为1~2μm,充斥细胞浆内。生精细胞凋亡状态:核固缩、边聚、破碎、变形。
6.3.2 颗粒型包涵体病毒在生精细胞内形成包涵体,细胞胀大或不胀大,甚至缩小,呈紫色颗粒状(嗜碱性)、大小不一、多少不一、可布满细胞质,也可见星星点点分布,生精细胞凋亡状态:核固缩、浓染、边聚、破碎,核消失。
6.3.3 针状型包涵体病毒在生精细胞胞质内形成包涵体,呈针状小体、大小不一、多少不一,散在细胞质中,生精细胞凋亡状态:核固缩、浓染、边聚、破碎,可见病毒颗粒侵犯和破坏细胞核。
6.3.4 空泡型包涵体病毒感染后导致精子细胞大量凋亡状态:多核、核固缩、浓染、破碎、边聚、分化不良,细胞质内产生空泡为空化细胞,空泡多少不一、大小不一,以小空泡为主。
6.3.5 猫头鹰眼型包涵体这是典型病毒感染形成的包涵体模式,生精细胞的核周围有晕圈及细胞质内有包涵体,呈“猫头鹰眼”(owl’s eye)。生精细胞凋亡状态:核固缩、浓染、边聚、破碎。
7 病毒感染的治疗
更昔洛韦(ganciclovir)或二羟基丙氧甲基鸟嘌呤(丙氧鸟苷DHPG)是鸟嘌呤衍生物,较无环鸟苷具有更强的抗CMV活性。对CMV视网膜炎或结肠炎有效,有效率为70%~90%,对于CMV肺炎,更昔洛韦同CMV免疫球蛋白合用时有效率达50%~70%。剂量:有免疫缺陷的重度感染者用7.5~10mg/kg/d维持,分2~3次静滴,14d后继续以5mg/kg/d维持,治疗1~2个月,其毒性有中性粒细胞减少。磷甲酸(foscarnet,phosphonoformate,PFA):治疗AIDS患者的CMV视网膜炎有一定的疗效。剂量150mg/kg/d,静滴。副作用有肾功能损伤。腮腺炎的治疗效果与机制介绍。
夏利报道对HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ580例患者进行排毒与药物干预的观察,排毒阳性299例(51.6%)。对299例排毒阳性患者进行药物干预,盐酸伐昔洛韦片0.3g,2次/d,×6个月;阿昔洛韦咀嚼片,0.4g,3次/d,×6个月,对照组不服任何药物。在服药5d、10d、4个月、6个月检测治疗组、无症状组、对照组等脱毒HSV-DNA的情况。在药物治疗组5d后发现有一定抑制排毒效应,4、6个月后有明显的抑制排毒作用,但在停药1个月后又有明显的排毒作用。药物干预可抑制排毒,停药极易复发。
综上所述,病毒感染是当前热门话题,实验诊断学必须未雨绸缪。笔者虽在腮腺炎患者的精液中检出病毒感染生精细胞的包涵体,但是不能排除有交叉感染或其他病毒感染的可能性,因为仅限于形态学观察,难免失误,为此,需要多角度(免疫学)、多方法(分子生物学)地深入研究与观察。但在显微镜下观察必须注意细节,细小的内容将改变认识、理解,启迪思路,更激发观察力,创造出一些新的认识,也许这就是显微镜下观察的秘诀与乐趣。为此,将在精液中检出的包涵体形态显示,本着资源共享,提供有识之士深入研究时参考,共同充实和完善精液病理诊断学的内容,推动检验医学、男性不育症的诊疗和性疾病预防医学的发展。
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