海藻糖在人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻中初步应用
文章导读:回顾性分析2014年1月至2015年12月在我院生殖中心行卵母细胞玻璃化冷冻的8例患者,解冻后行卵胞浆内单精子显微注射,记录存活、受精、卵裂及妊娠情况。结果:8例患者共解冻52枚胚胎,存活43枚,存活率82.69%,受精率67.44%,卵裂率89.66%;1例患者取消移植,7个移植周期获得临床妊娠3例,其中胚停1例,活产1例,继续妊娠1例。 |
随着人类辅助生殖技术的发展需要,卵母细胞玻璃化冷冻技术的应用越来越普遍,早在1999年Kuleshova等就将玻璃化冷冻技术成功应用于卵母细胞的冷冻,国内多家中心报道了应用玻璃化冷冻技术冷冻人类成熟卵母细胞均取得较好的妊娠结局。海藻糖由于其本身独特的生物学特性及冷冻方面的作用机制,在卵母细胞冷冻保存上的优势,引起诸多学者的关注,但其在人类成熟卵母细胞冷冻上临床应用价值仍需要进一步探讨。本文就2014年1月至2015年12月在我生殖中心行卵母细胞玻璃化冷冻的8例患者解冻情况进行回顾性分析,旨在探讨海藻糖作为非渗透性冷冻保护剂在临床应用的价值。
1 资料与方法
1.1 研究对象
2014年1月至2015年12月在安徽省妇幼保健院生殖中心行卵母细胞玻璃化冷冻后解冻的8例患者。女方平均年龄(29.13±6.88)岁,不育年限(4.5±1.60)年;1例因取卵当天男方取精失败并拒绝附睾穿刺取精,将成熟卵母细胞全部冷冻;7例为获卵数≥20枚,自主要求将部分成熟卵母细胞冷。全部患者均在知情同意情况下签署卵母细胞冷冻解冻知情同意书。
1.2试剂与耗材 (1)玻璃化冷冻试剂盒(Cryotech, shinjuku-ku, Tokyo, 日本)主要成份乙二醇、二甲亚砜、海藻糖、羟丙基纤维素,包含有平衡液(Equilibration Solution,ES)、玻璃化液(Vitrification Solution,VS);(2)解冻试剂盒(Cryotech, shinjuku-ku, Tokyo, 日本)主要成份海藻糖、羟丙基纤维素,含有解冻液(Thawing Solution,TS)、稀释液(Diluent Solution,DS)、洗液(Washing Solution,WS);(3)冷冻载体为Cryotop(日本加藤);(4)培养液为Vitrolife系列(瑞典)。
1.3 卵母细胞冷冻和解冻
各取0.5mL ES、VS于Falcon 3037皿内,在室温(24℃)下平衡,将去除颗粒细胞的成熟卵母细胞(1次最多3枚)移入平衡液ES中平衡5~15min,然后移入冷冻液VS中,充分混匀后迅速将卵母细胞置于冷冻载体Cryotop顶端,并立刻投入液氮中,时间控制在60s内。取1mL解冻液TS于Falcon 3653皿中置于培养箱37℃预温30min,各取0.5mL解冻液DS、WS1和WS2于Falcon 3037皿在室温下平衡,将拟解冻患者载有其卵母细胞的载体Cryotop从液氮罐中取出,将TS置于37℃体视镜加热载物台上,迅速将Cryotop顶端置于TS中,使得卵母细胞直接脱落在TS中1min,然后在室温下依次将卵母细胞转入DS、WS1、WS2中3min、3min和3min。最后将卵母细胞移入过夜平衡的培养液中,置于37℃、6%CO2的培养箱中培养。3h后取出在倒置显微镜下观察,卵母细胞形态正常、结构完整、没有胞质变色及透明带断裂时判断为存活,并行ICSI受精。
1.4 受精、培养和移植
对存活的成熟卵母细胞行ICSI受精,受精后转入体外受精培养液中培养,授精16~18h后观察受精情况,以卵母细胞的胞浆内出现双原核为正常受精,并移入卵裂期培养液中继续培养,第3d进行形态学观察:卵裂球等大,形态规则,胞质均匀清晰,碎片无或<10%,为Ⅰ级胚胎;卵裂球不等,形态欠规则,碎片10%~25% 为Ⅱ级胚胎;细胞数在6~10之间的Ⅰ级胚胎和细胞数在7~9之间的Ⅱ级胚胎均为优质胚胎。优先选择优质胚胎进行移植。
1.5 妊娠结局确定
胚胎移植后黄体支持,14d抽血验β-HCG,当血β-HCG>5.3U/L时为生化妊娠,移植后第35d进行阴道超声检查,有孕囊及胎心搏动时为临床妊娠。
2 结果
8例患者共解冻共52枚胚胎,存活43枚,存活率82.69%,受精率67.44%,卵裂率89.66%。1例患者因无胚胎可用取消移植,7个移植周期获得临床妊娠3例,其中1例孕14+3周胚停,1例孕40周剖宫产分娩1女孩,体重3.0kg,发育均正常;1例继续妊娠中。
3 讨论
玻璃化冷冻技术因其在冷冻过程中形成“玻璃态”而得名,高浓度的玻璃化冷冻保护剂尤为重要,选择合适的冷冻保护剂既要满足快速降温形成“玻璃化”,又要尽量减少对细胞的毒性作用。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1, 1-糖苷键构成的性质最为稳定的天然双糖,几乎不被一般酶类分解,在人体内可水解成葡萄糖。海藻糖对于环境变化形成的应激状态具有高抗性,当生物体处于高温、低温冷冻、高渗透压等恶劣环境条件时,可以保护机体内蛋白质等大分子活性,而蔗糖、葡萄糖等均不具有这一功能。海藻糖由于其本身独特的生物学特性及冷冻方面的作用机制,以及在卵母细胞冷冻保存上的优势,早在2000年美国哈佛大学Eroglu等的研究就发现利用低浓度海藻糖作为冷冻保护剂可以大大提高哺乳动物细胞的存活率,并且随后在人卵母细胞玻璃化冷冻上研究得出结果认为海藻糖能够帮助细胞抵抗低温损伤,可以作为人类卵母细胞冷冻保护剂,Younis等也报道了联合使用海藻糖和二甲亚砜玻璃化冷冻人卵母细胞,解冻后获得较高存活率。本文采用海藻糖作为玻璃化冷冻保护剂对8例患者卵母细胞进行冷冻解冻,共冷冻卵子58枚,解冻52枚,存活43枚,存活率82.69%,行ICSI授精后29枚卵子正常受精,受精率67.44%,获得26枚卵裂胚胎,卵裂率89.66%,第3d优质胚胎11枚,优胚率42.31%。7个移植周期获得临床妊娠3例,临床妊娠率42.86%。取得较好的临床结局,与文献报道采用蔗糖作为冷冻保护剂获得的临床结局相近。虽然人卵母细胞冷冻技术仍存在一定的瑕疵,尚未被纳入大多数生殖中心辅助生殖的诊疗常规,但随着日常工作的需要和冷冻技术的改进,特别是卵子的较低利用率,对于一次促排卵可以获得较多成熟卵母细胞的患者来说,在保证自身妊娠成功的前提下,将剩余的卵母细胞捐赠,会积极推动卵子库的建设。因此,通过不断探索新的人卵母细胞冷冻方法,改善冻融后卵母细胞发育潜能,有效提高卵母细胞冻存效率,卵母细胞冷冻技术将会得到越来越广泛的应用。
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