无原核有双极体的卵母细胞体外发育潜能及移植结局的探讨
文章导读:回顾性分析在134个观察到0PN(2PB)卵母细胞常规IVF周期中,0PN(2PB)卵母细胞与同周期正常受精(2PN)的卵母细胞一起培养至第3d(D3),根据卵裂球数目、大小、碎片、细胞质均匀度进行胚胎质量评估,8个周期移植完全来源0PN(2PB)卵母细胞发育的胚胎。结果:134个周期中共获卵1107枚,0PN(2PB)卵母细胞240枚,2PN卵母细胞639枚。0PN(2PB)卵母细胞形成率、卵裂率、D2优胚率、D3优胚率分别21.7%、80.8%、46.9%、28.9%;2PN形成率、卵裂率、D2优胚率、D3优胚率分别57.7%、97.0%、55.2%、40.8%。0PN(2PB)在形成率、卵裂率、D3优胚率与2PN比较有显著差异(P<0.01);D2优胚率与2PN比较有差异(P<0.05)。同一周期中0PN(2PB)卵母细胞与2PN在形成数、卵裂数、D2优胚数、D3优胚数比较,有显著差异(P<0.01)。8个周期移植完全来源0PN(2PB)胚胎,临床妊娠4例,双胎1例,单胎3例,3个健康婴儿出生;2例孕早期流产,着床率38.5%(5/13),流产率50.0%(2/4)。 |
在人类体外受精过程中,卵母细胞正常受精的标准为:受精后16~20h,显微镜下观察到2个原核(PN)和2个极体(PB) 。但是在实际工作中,有少部分卵母细胞受精后16~20h,显微镜下观察到无原核有双极体0PN(2PB)的卵母细胞。本文通过对此类卵母细胞进行体外培养至D3,观察其发育潜能并部分进行移植,评估其在临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 研究对象
2014年1月至2015年9月在我院生殖中心行常规IVF-ET治疗周期中,134个周期观察到0PN(2PB)的卵母细胞,女方平均年龄(30.96±4.53)岁,获卵数(8.26±4.52)枚。我们对0PN(2PB)的卵母细胞与同周期正常受精(2PN)的卵母细胞一起培养至第3d(D3),根据卵裂球数目及大小、碎片、细胞质均匀度进行胚胎质量评估。
1.2 方法
1.2.1 促排卵方案 采用长方案、短方案及微刺激方案促排卵,B超监测卵泡发育情况,当出现1~2个主导卵泡直径≥18mm时,于当晚注射绒毛膜促性腺激素(HCG) 5000~10000IU,34~36h在阴道B超引导下取卵。
1.2.2 精液的准备 患者丈夫取卵日上午手淫取精,采用密度梯度离心+上游法处理后,置CO2培养箱中备用。
1.2.3 体外受精-胚胎培养 取卵后2~4h采用3037法加精(卵母细胞<10枚/孔),受精浓度5×105~6×105/mL,精卵共同培养4~5h后,脱颗粒细胞,将卵母细胞转移到生长盘(10%SPS-CM)培养,受精后16~20h观察原核的形成,继续培养第2d(D2)、第3d(D3)观察胚胎发育情况。
1.2.4 胚胎的形态学评分 D2胚胎评分法:Ⅰ级胚胎:胚胎发育速度正常,卵裂球均匀、数目均等,细胞质均一、无空泡,碎片≤5%。Ⅱ级胚胎:胚胎发育速度正常,卵裂球均匀或大致均匀、数目均等或大致均等,细胞质均一、无空泡,碎片≤10%。Ⅲ级胚胎:胚胎发育速度大致正常,卵裂球不均匀或均匀、数目不均等或均等,细胞质有少量空泡,碎片≤15%。Ⅳ级胚胎:胚胎发育速度异常,卵裂球不均匀、数目不均等,细胞质不均一,碎片10%~50%。D3胚胎评分法:Ⅰ级:细胞数≥7,卵裂球均匀,细胞质均一,碎片≤5%。Ⅱ级:细胞数≥7,卵裂球均匀或大致均匀,细胞质均一,碎片≤10%。Ⅲ级:细胞数≥6,卵裂球不均匀,细胞质不均一,碎片≤20%。Ⅳ级:细胞数≥6,或细胞数≤5,卵裂球严重不均匀,细胞质不均一或有空泡,碎片>20%。Ⅰ级、Ⅱ级为优质胚胎。
1.3 统计学分析
所有数据经SPSS17.0软件包处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验;计数资料采用率(%)表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 134个IVF 周期中2PN、0PN(2PB)卵母细胞体外培养情况分析
134个周期中共获卵1107枚,0PN(2PB)240枚,2PN 639枚。0PN(2PB)形成率21.7%、卵裂率80.8%、D2优胚率46.9%、D3优胚率28.9%;2PN形成率57.7%、卵裂率97.0%、D2优胚率55.2%、D3优胚率40.8%。0PN(2PB)在形成率、卵裂率、D3优胚率与2PN比较有显著差异(P<0.01);D2优胚率差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 同一周期中 2PN 、0PB(2PB)卵母细胞在形成数、卵裂数、D2优胚数、D3优胚数分析
同一周期中0PN(2PB)卵母细胞在形成数、卵裂数、D2优胚数、D3优胚数与2PN比较,有显著差异(P<0.01)。
2.3 8个周期 D3完全移植0PN(2PB)胚胎的妊娠结局
完全移植0PN(2PB)胚胎共8个周期,临床妊娠4例,双胎1例,单胎3例,2例孕早期流产,着床率38.5%(5/13),流产率50.0%(2/4)。
3 讨论
在体外受精-胚胎移植中,通常我们在倒置显微镜下观察卵母细胞的原核和极体,卵母细胞中的原核表现是多样的:无原核(0PN)、双原核(2PN)、单原核(1PN)及多原核(PN≥3),无原核(0PN)卵母细胞有三种表现形式:①无原核、无极体0PN(0PB)卵母细胞;②无原核、有1个极体0PN(1PB)卵母细胞;③无原核、有双极体0PN(2PB)卵母细胞。第二极体是受精过程中精子激活卵子使卵母细胞恢复第二次减数分裂的形态学参数,第二极体的排出反映了在受精过程中精子激活了卵母细胞,0PN并不一定表示受精的失败,受精后16~20h观察到0PN(2PB)卵母细胞,出现这种情况可能原因是:①原核形成延迟;②原核过早消失;③第一极体碎裂,误认为双极体。有文章报道,在IVF-ET中,约30%~40%卵子体外受精16~20h后显微镜下观察未见原核。本研究中,0PN(2PB)卵母细胞的形成率为21.7%,低于之前报道的0PN约30%~40%0PN形成率,这跟纳入的卵母细胞有关,本研究纳入的是未见原核有双极体0PN(2PB)的卵母细胞,排除0PN(0PB)及0PN(1PB)的卵母细胞。将0PN(2PB)卵母细胞与同周期的2PN卵母细胞一起培养至D3,0PN (2PB)的卵母细胞与2PN卵裂率比较有显著差异(P<0.01),D3优胚率显著低于2PN胚胎(P<0.01);D2优胚率与2PN比较有差异(P<0.05)。胚胎发育是一个动态变化的过程,随着体外培养时间延长至D3,多数0PN(2PB)胚胎在发育过程中产生较多碎片或发育速度较慢或停滞发育,0PN的卵母细胞中大约20%可发育成形态正常的胚胎,0PN(2PB)胚胎具有一定的发育潜能,但其发育潜能较低。同一患者同一周期,在相同的临床及实验室条件下,0PB(2PB)卵母细胞在形成数、卵裂数、D2优胚数、D3优胚数与2PN比较差异显著(P<0.01)。原核形成可视为受精的标志,在适当的时间没有出现正常的原核数目则会影响到胚胎的发育潜能。在IVF-ET中,要提高临床妊娠率,首先要选择移植具有发育潜能的胚胎,在同一周期中,2PN胚胎D3优胚数显著高于0PN(2PB)胚胎,因此,IVF-ET周期中是优先移植2PN胚胎。对于0PN(2PB)卵母细胞,我们无法确定其原核的数目是2PN、1PN还是多PN,事实上,部分0PN(2PB)胚胎是正常受精的胚胎,只是因为错过了最佳的观察时机,被认为是异常受精。Manor等、戴善军研究表明,0PN胚胎染色体二倍率分别为57%、45.2%~58.1%,提示正常受精。Malcov等通过荧光原位杂交(FISH)方法分析13,18,21,X,Y五条染色体,再次证明部分0PN的胚胎是正常的二倍体。本研究结果显示,少数0PN(2PB)胚胎也能发育成优质胚胎,如果将这类胚胎全部销毁,会造成胚胎资源的浪费,且近年来越来越多研究表明,0PN(2PB)胚胎可作为被选胚胎进行移植,国内外已有报道,并获得健康出生婴儿。本中心D3完全移植0PN(2PB)胚胎8个周期中,临床妊娠4例,双胎妊娠1例,单胎妊娠3例,其中2例在孕早期流产,3名健康婴儿出生,着床率38.5%,流产率50.0%,但由于病例数少,无统计学意义。染色体非整倍体改变是导致胚胎移植后受孕率低、胚胎着床率低且流产率高的重要原因之一。0PN(2PB)胚胎染色体异常发生率高,选择此类胚胎移植,即使部分胚胎能够着床,大多可能因其存在染色体异常而导致胚胎停止发育、流产等,最终妊娠失败。
综上所述,结合我中心已有患者移植0PN(2PB)胚胎成功出生健康婴儿,我们认为,0PN(2PB)胚胎发育潜能较低,若少数患者因2PN胚胎质量差,无移植胚胎或无2PN胚胎时,0PN(2PB)胚胎可作为备选胚胎,在患者充分知情同意下,进行移植。当诊断临床妊娠后,主诊医师应嘱其严格注意胎儿发育,进行产前诊断,包括羊水染色体的检查。若能结合胚胎植入前遗传学诊断(PGD)证实为正常的二倍体后进行移植,具有重要的临床应用价值。
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