淋巴细胞主动免疫治疗原因不明性不孕IVF患者的疗效观察
文章导读:随机选取2011年5月至2015年9月在本院生殖中心进行IVF助孕、封闭抗体(BA)阴性的462例不明原因性不孕患者作为研究对象,按照患者是否行免疫治疗分为治疗组(187例)和对照组(275例),应用流式细胞仪检测两组患者外周血BA(抗CD3+、CD4+、CD8+)的封闭效率情况,观察淋巴细胞主动免疫治疗IVF-ET患者的妊娠结局。结果:免疫治疗组患者血清抗CD3+、CD4+、CD8+的表达率明显高于对照组(P<0.05);免疫治疗组患者的胚胎着床率、临床妊娠率均明显高于对照组(P<0.05);而两者的流产率、获卵数、受精率、优胚数及移植胚胎数比较,其差异均无统计学意义(P>0.05)。 |
现阶段我国生育基数大,受不孕症困扰的患者越来越多。针对不孕症患者,辅助生殖技术为其带来了希望。虽然目前控制性超促排方案及实验室培养技术都有了很大的进步,但目前的临床妊娠率仍较低。因而如何通过采用临床治疗手段和优化实验室技术是解决问题的可能出发点。众所周知,妊娠是极其复杂及协调的生理过程。妊娠的成功建立及维持可能涉及遗传、内分泌、解剖、免疫等多方因素的影响,而妊娠作为同种半异体移植,其母体-胎儿界面的免疫耐受可能是成功妊娠的关键所在。一旦这一免疫耐受状态被打破,胚胎就会遭受母体免疫系统的排斥,导致不孕或流产。近年来,越来越多的研究发现,封闭抗体(blocking antiboby, BA)作为针对母体人类白细胞Ⅱ抗原、滋养层及淋巴细胞交叉反应抗原而产生的特异型IG抗体,它能够与胚胎滋养细胞抗原或母体淋巴细胞结合,防止胚胎受母体免疫系统排斥,从而使妊娠得以维持。封闭抗体的缺乏或减少可致母胎免疫耐受平衡紊乱,导致不孕及流产的发生。目前淋巴细胞主动免疫是治疗封闭抗体缺乏最广泛及有效的方法,但由于受到样本量、研究方法等限制,目前淋巴细胞主动免疫治疗作为干预手段的临床效果还存在争议。本研究应用淋巴细胞主动免疫治疗封闭抗体阴性的不明原因性不孕体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者,旨在探讨其对原因不明性不孕IVF-ET患者妊娠结局的影响及意义。
1 资料和方法
1.1 研究对象
选取2011年5月至2015年9月在我院生殖中心进行IVF助孕、BA阴性的462例不明原因性不孕患者作为研究对象,按照患者是否愿意进行免疫治疗分为两组,其中治疗组(行免疫治疗者)187例,对照组(未行免疫治疗者)275例。所有患者均已在我院或外院行2~3周期IUI助孕,并符合以下标准:输卵管造影或腹腔镜提示双侧输卵管通畅;月经规律、基础内分泌及排卵正常;双方染色体核型正常;优生五项及抗核抗体、抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、抗精子抗体等生殖相关抗体均阴性;甲功、肝肾功血糖及双方传染病检测均正常; 排除子宫畸形、既往宫腔镜提示有宫腔病变、子宫内膜异位症及生殖道感染;男方精液符合WHO正常范围。两组患者年龄及不孕年限,差异均无统计学意义(P>0.05)。
1.2 淋巴细胞主动免疫治疗方法
人淋巴细胞分离液由天津市颧洋生物科技有限责任公司生产,供血来自于排除乙肝及传染病的患者丈夫或无关第三者。无菌抽取供体静脉血20mL,肝素抗凝后以300r/min离心,制成淋巴细胞悬液,使其浓度在(30~60)×106/mL之间,取细胞悬液2~3mL分为4~6个点注入患者前臂外侧皮下,每3周注射1次,4次为1疗程,完成4~8次治疗2周后复查BA,并予以尽快IVF助孕。
1.3 IVF助孕控制性卵巢刺激方案
所有患者均采用常规长方案,即在前次月经周期的黄体中期连续肌注短效醋酸曲普瑞林(成都天台山制药有限公司,国药准字H20058648,产品批号:160502)0.1mg/d,降调节14~20d后根据患者情况予基因重组促卵泡素(rFSH,果纳芬,默克雪兰诺有限公司,注册证号:S20130055,产品批号:AU016563)或高纯度尿促卵泡素(FSH-HP,丽申宝,丽珠集团丽珠制药厂,国药准字H20052130,产品批号:160503)150~300U启动,同时给予隔日曲普瑞林0.1mg,当有1个优势卵泡直径达18mm或2个卵泡直径达17mm以上者,当晚予以重组人绒促性素(艾泽,默克雪兰诺有限公司,注册证号:S20130091,产品批号:BA035387)0.25mg皮下注射,34~36h后超声引导下阴道穿刺取卵。3d后行胚胎移植,其余胚胎继续养囊后冷冻。
1.4 疗效评定及观察指标
1.4.1 检测方法及疗效评价 应用流式细胞仪检测两组患者体内封闭抗体(抗CD3+、CD4+、CD8+)的封闭效率情况,并对比其妊娠成功率;BA判断标准:以抗CD3+、CD4+、CD8+三项中有一项值为负,则诊断为BA阴性;如三项均为正值,则为BA阳性。
1.4.2 观察指标 移植后2周抽血检测血β-HCG阳性的患者4周后阴道超声检查探及宫内孕囊为临床妊娠,并随访至妊娠3个月。
1.5 统计学方法
数据分析采用SPSS13.5统计学软件处理,计量资料的两组间比较采用t检验;计数资料采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者临床妊娠相关情况的比较
本研究数据显示,免疫治疗组的胚胎着床率、临床妊娠率均明显高于对照组,其差异有统计学意义(P<0.05);而两者的流产率、获卵数、受精率、优胚数及移植胚胎数比较,其差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.2 两组间封闭抗体效率的比较
数据显示:在免疫治疗前治疗组与对照组的封闭抗体均为阴性,两者差异并无统计学意义(P>0.05);随着免疫治疗的进行其患者体内封闭抗体 (抗CD3+、CD4+、CD8+)值逐渐升高,而封闭抗体(抗CD4+/抗CD8+)比值逐渐下降,与对照组相比,其差异均有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
现代生殖免疫学认为,胚胎移植是一种同种半异体移植。正常情况下,胚胎在母体宫腔内免受排斥,主要有耐于母胎界面的免疫耐受。虽然有关母胎界面的免疫耐受机制目前仍尚未完全明了,然而一旦母胎双方免疫平衡被打破,母体可能会对胚胎产生排斥,导致不孕或流产。因而如何维持母体-胎儿界面的免疫耐受对妊娠的正常进行至关重要。近年来研究表明,封闭抗体是维持母胎免疫耐受的重要特异性抗体,封闭抗体的缺乏或减少可导致母体免疫反应增强,导致不孕或流产的发生。而淋巴细胞主动免疫是治疗封闭抗体缺乏的有效方法,其主要是通过配偶或健康第三方外周血淋巴细胞刺激母体免疫系统诱导其体内产生抗配偶CD3+、CD4+及CD8+的抗体,进而封闭胚胎滋养细胞抗原或母体淋巴细胞,防止胚胎遭受母体免疫系统排斥,从而维持胚胎正常发育。这已在反复着床失败及复发性流产的研究中得以证实。但目前国内外尚鲜有关淋巴细胞主动免疫治疗不明原因性不孕患者的报道。本研究通过流式细胞仪检测了两组间封闭抗体的封闭效率情况,对淋巴细胞主动免疫治疗封闭抗体阴性的不明原因不孕患者IVF助孕效果进行了研究,结果显示随着免疫治疗的进行,免疫治疗组中抗CD3+、CD4+及CD8+的逐渐转阳其着床率及临床妊娠率均明显高于对照组,这与国内外部分报道相符,提示了淋巴细胞主动免疫治疗可能对不明原因不孕IVF-ET的患者有效,可改善其胚胎妊娠结局。而在两者的流产率方面,虽然治疗组相对于对照组其流产率呈逐渐下降的趋势,但两者比较差异并无统计学意义,表明淋巴细胞主动免疫治疗可能并不改善原因不明性不孕IVF-ET患者的流产率。这与Khonina等及Nonaka等研究结果不相符,分析其原因可能与以下几点有关:(1)鲜胚周期中有可能因患者本周期优质胚胎数少而选择性将部分质量稍差的胚胎一并移植以及在胚胎评级中操作者评估胚胎的主观因素,有可能导致胚胎选择偏倚;(2)本研究中治疗组患者的年龄稍偏大,可能跟年龄与胚胎染色体非整倍发生率呈正相关性有关。(3)本实验样本量偏少,可能选择的人群代表性有限。尽管有关淋巴细胞免疫治疗的研究原理主要是通过封闭抗体对配偶CD3+、CD4+及CD8+抗原的封闭效应来维持母体的免疫耐受。但同时CD3+、CD4+及CD8+作为T淋巴细胞主要组成部分,其在本研究中也显示,相对于对照组,免疫治疗组中随着免疫治疗后抗CD3+、CD4+及CD8+逐渐转阳的同时,抗CD4+/抗CD8+两者比值也呈逐渐下降的趋势,这一现象可能也在一定程度上间接反映的一种趋势:T淋巴细胞亚型的改变可能参与了维持胚胎妊娠的过程,其可能是外周血淋巴细胞主动免疫治疗除诱导封闭抗体外,也可通过促使Th0型细胞因子向Th2型细胞因子转换,或通过HLA-G诱导CD8+ T细胞表达并启动Fas/Fasl凋亡途径,使活化的CD8+ T细胞发生Fas /Fasl程序性死亡,进而诱导母体的免疫耐受,保护胚胎免受母体排斥,促进妊娠的正常维持。这与胡永琴等在复发性流产的研究结果相类似,但其特异性及具体机制还有待进一步研究。综上所述,淋巴细胞主动免疫治疗可能有助于提高部分不明原因不孕患者的妊娠率,因而对于BA阴性的不明原因不孕患者在进行IVF助孕前给予淋巴细胞主动免疫治疗可能在某种程度上对其妊娠结局有一定参考价值。但由于本研究样本量偏少,其治疗的有效性还需进一步大样本前瞻性的研究。
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