卵巢组织冷冻保存和移植的研究进展
文章导读:卵巢组织冷冻移植作为育龄女性癌症患者保存生育力和恢复内分泌功能的治疗方案之一,发挥着越来越重要的作用,它甚至是青春期女性患者的唯一选择。但是,卵巢组织冷冻移植比较复杂,其过程包括卵巢组织的获取、卵巢组织的冷冻复苏、冻融后的活力检测、复苏后再移植等步骤,而每个步骤又有诸多影响因素,都会影响冷冻保存和移植的效果。本文对卵巢组织冷冻保存和移植的各主要环节进行了论述,并阐述了该技术现存的主要问题及该领域的新进展。 |
在过去的几十年间,育龄癌症女性的生存率得到了显著的提高,但是抗癌症治疗特别是盆腔放疗及高剂量化疗药物的使用,都会损害女性患者的卵巢功能、降低卵泡池的储备,最终影响其生育力,因此在进行治疗前首先进行生育力的保存是非常必要的。卵巢组织冷冻移植能够为即将接受化疗和/或放疗的育龄女性和青春期女孩保存生育力,恢复内分泌功能,使她们将来拥有重建生育力、获得后代的机会。2004年Donnez等报道了第1例卵巢皮质冷冻复苏后经自体移植使一名霍奇金淋巴瘤患者恢复了生殖能力,并获得了一名女婴。2005年,Meirow等首次将一名因化疗而卵巢早衰的女性患者卵巢组织冷冻,再将复苏卵巢组织移植后成功恢复排卵,并经体外受精(in vitro fertilization, IVF)获得了活婴出生。这名患者在28岁时被诊断为非霍奇金淋巴瘤,并在第1次和第2次化疗之间进行了卵巢组织的冷冻保存。2003年进行了卵巢组织移植,9个月后观察到了卵泡的自然发育,患者接受了IVF治疗,最终获得了一名健康女婴。到目前为止通过卵巢组织冷冻移植出生的婴儿已经有大约100名,说明这项技术的应用是非常成功的。
1 卵巢组织的获取
一般情况下卵巢组织的获取是通过腹腔镜或开腹手术完成的,卵巢组织切除的范围取决于术后卵巢衰竭的可能性。多数情况下是部分卵巢切除,即切掉1/2至2/3的卵巢组织,某些情况下是整个卵巢切除。相对于整个卵巢切除来讲,患者更容易接受部分切除。研究显示,冻融过程和缺血性损伤会导致许多卵泡都损失掉,因此应该切除足够大的组织块以保证卵泡储备。一旦获取到卵巢组织,应立即放入准备好的培养液中运送到实验室准备接受冷冻。样本送达实验室后立即转移至含有培养液的培养皿中,置于冰块上保持4℃。如果需要从组织中获取不成熟卵母细胞进行IVM,则需把卵巢组织保持在室温下。随后把卵巢皮质组织从髓质上剥离下来切成5×10mm大小、2~3mm厚度或者更小更薄的条块准备冷冻。冷冻之前,固定一块皮质组织,石蜡包埋,进行HE染色来评估原始卵泡的存在,以及对恶性肿瘤细胞进行早期检测。此外,也应该对切除的髓质组织进行评估,检测是否存在癌细胞。
2 卵巢组织冷冻保存
影响卵巢冻存的因素很多,包括冷冻方法、冷冻保护剂的使用、冷冻载体的选择、卵巢皮质块的大小、冷冻液渗透的时间及温度等。
2.1 冷冻方法
包括程序化冷冻和玻璃化冷冻。程序化冷冻是通过程序冷冻仪按照设定好的程序逐步缓慢降温,最后投入到液氮中冷冻保存,是比较成熟的传统冷冻方法。近些年来,玻璃化冷冻逐渐发展并得到了越来越多的应用,玻璃化冷冻是将高浓度的冷冻保护剂通过体积微小的载体,在超快速降温过程中,使其迅速转变为玻璃样的固态,从而避免细胞内冰晶的形成,达到冷冻保护的作用。
2.1.1 程序化冷冻 目前应用较多的程序化冷冻,基本上是以Gosden等的方案为基础的,该冷冻方案中先将切割好的卵巢组织薄片放入在冰上预冷的含1.5mol/L二甲亚砜( DMSO)+10%胎牛血清(FCS)的Leibovitz L-15溶液中平衡15min,再将装有组织片的冷冻管转入程序冷冻仪中,以 2℃/min 的速度由0℃降至-7℃,在-7℃保持10min后植冰,再以0.3℃/mim 的速度降至-40℃,再以10℃/min的速度降至-140℃,随后投入到液氮中保存。解冻时先将冷冻管在空气中停留2min,再将冷冻管直接投入37℃的水浴内进行复苏,待完全解冻后,用不同浓度的解冻液依次洗涤以去除冷冻保护剂。现在的方法都略有改进,Meirow等的冷冻方案中以卵子冲洗缓冲液作为基础,其中含有1.5M/L的DMSO+15%的合成血清替代物(SSS)+0.1M/L的蔗糖。该方案要求卵巢皮质条要足够薄(<1mm),并且平衡温度为4℃,其它降温步骤相同。该方案的卵泡存活率可以高达84%。程序化冷冻的优点是效果稳定,缺点是需要昂贵的冷冻设备、消耗大量液氮、冷冻过程相对复杂。
2.1.2 玻璃化冷冻 与程序化冷冻相比,玻璃化冷冻因其操作简单、耗时短、费用低、不需要专门的冷冻设备等优点,成为近几年发展较快的方法,目前已广泛应用于人类胚胎及卵母细胞的冷冻保存。玻璃化冷冻要求使用高浓度的冷冻保护剂抑制冰晶的形成,但高浓度的冷冻保护剂具有较高的细胞毒性,可以通过使用不同冷冻保护剂来减少冷冻保护剂的毒性。Keros等在一项平行对照的研究中显示,玻璃化冷冻方法对卵泡保存的效率与程序化冷冻基本接近,然而,玻璃化冷冻可以更好的保存卵巢基质。Keros等的玻璃化冷冻方案是,先将皮质条放入含10mg/mL HSA的HBSS溶液中冲洗5min,随后依次转入玻璃化冷冻液中:VS1(0.35M DMSO, 0.38M PrOH, 0.38M EG) 5min,VS2 (0.7M DMSO, 0.75MPrOH, 0.75M EG) 5min,VS3 (1.4M DMSO, 1.5M PrOH, 1.5M EG) 10min。VS1和VS2在室温,VS3在4℃操作,VS3结束后直接投入液氮(-196℃)。尽管目前还没有关于玻璃化冷冻卵巢组织成功妊娠及出生的报道,但作为一种新技术,卵巢组织的玻璃化冷冻将越来越受到重视。
2.2 冷冻保护剂
冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两大类。渗透性保护剂通过渗入细胞而降低细胞内水分,避免细胞内冰晶形成,常用的有二甲亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)和甘油等;非渗透性保护剂不能进入细胞,但可以提高细胞外溶液的渗透压,进而引起细胞脱水,避免细胞内冰晶形成,常用的有蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。几种冷冻保护剂混合使用的效果往往优于单一。细胞密度和组织结构会影响冷冻保护剂的渗透。冷冻保护剂在鼠类卵巢的渗透相对较快,鼠类卵巢基本上完全由相邻的发育卵泡构成,几乎没有纤维组织因此相对容易渗透。然而完全不同的是,人类卵巢组织具有致密的纤维,因此冷冻保护剂很难渗透。冷冻保护剂虽然可以减少冷冻过程中的细胞损伤,但其本身大多具有细胞毒性,特别是渗透性冷冻保护剂。Aubard等分别比较了EG、DMSO、PROH及甘油对卵巢组织冷冻移植后卵泡存活率的影响,结果显示原始卵泡的成活率EG最高,达到了83%,其它依次为 74%、44%及10%。Demirci等研究发现随着DMSO和PROH浓度的增加,它们对卵巢组织的细胞毒性也随之增加。因此,在实践中可以在有效范围内降低冷冻保护剂的浓度来减少其细胞毒性。
2.3 冷冻载体
适宜的冷冻载体能够提高冷冻速率,传统的程序化冷冻多采用1.8mL的冷冻管,而玻璃化冷冻载体的选择较多,甚至可以在玻璃化过程中不使用任何载体。目前用于卵巢组织冷冻的载体有许多,主要分为封闭式载体和开放式载体。封闭式载体可避免组织与液氮直接接触,但是降温比较缓慢,包括冷冻管、封闭式拉长麦管、冷冻袋等。开放式载体可实现快速降温,但是组织与液氮直接接触,包括冷冻环、冷冻载杆、金属网条、尼龙网、电镜铜网、微滴法 、直接覆盖玻璃化(direct cover vitrification,DCV)等。开放式载体冷冻效果较好,但是存在生物污染的风险。
2.4 卵巢皮质块大小的选择
研究者们一直关注皮质块大小对卵巢组织冷冻保存效果的影响。如果卵巢皮质块较大,在冷冻的过程中冷冻保护剂的渗透比较困难,平衡时间过短,冷冻保护剂不能充分渗入; 平衡时间过长,就会导致冷冻保护剂对细胞产生毒性损伤。因此,目前的通常做法是将卵巢组织切成薄的皮质条,厚度在1mm左右,不宜超过2mm。
2.5 全卵巢冷冻
全卵巢冷冻跟卵巢皮质条冷冻方法类似,主要有慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法。随着器官移植技术的发展,新鲜卵巢移植在技术上完全成熟,并已有获得活产的报道,但目前尚无人类全卵巢冷冻后再移植获得妊娠及活产的报道。早在2002年Wang等报道将大鼠的整个卵巢进行冷冻,复苏后经血管吻合术进行整个卵巢的再移植,最终成功的获得了妊娠。这说明全卵巢冷冻保存是一种理想的保存女性生育能力的方法,但人类全卵巢冷冻的有效性和安全性还需进一步研究。全卵巢冷冻的两个关键性技术难题:一个是对整个器官实施完美的血管吻合术并且迅速恢复血流,另一个是建立一套完善的冷冻保存方案。然而,建立一套有效的全卵巢的冻存方案是极为复杂的。大量的冰晶是导致细胞机械性破坏的主要原因,冷冻保护剂在血管腔内的渗透不足可能导致血管内冰晶的形成,随后发生血管损伤和不可逆转的内皮损坏。尽管人类全卵巢冷冻存在许多技术上的挑战,包括冷冻保护剂的选择和冻融后组织的活性,但仍有学者进行了大量尝试。由于冷冻方案已经得到了改进,整个器官冷冻相关的技术难题已经部分解决,全卵巢冷冻进行生育力保存的前景已变得更加现实。尽管目前没有将人类全卵巢冷冻后进行移植的研究,但在大动物上进行的研究是令人鼓舞的。
3 卵巢组织的检测评估
卵巢组织冻融后可以通过石蜡切片HE染色初步判断冻融对卵巢组织造成的损伤程度,也可以应用TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口标记技术)检测和评估卵巢中卵母细胞和颗粒细胞的凋亡情况,还可以通过透射电镜分析细胞的超微结构。所有这些检测方法分析过的组织不能再用于移植,因为这些方法都具有细胞毒性。因此,未来的研究方向是设计出无毒的观察和计数方法,以减少卵巢组织的损失,减少不同组织条之间细胞数差异导致的样品误差,提高评估的真实性和准确性。卵巢皮质冷冻的主要顾虑就是冻融的卵巢皮质中可能存在隐藏恶性细胞的风险,这可能会导致再移植后疾病的复发。因此,对冷冻前后的卵巢组织进行微小残留灶的评估非常重要,这直接关系到患者的安全。研究表明,仅仅通过组织学分析对白血病患者冷冻组织进行残留肿瘤细胞检测时不一定能够确诊,但是通过RT-PCR技术能够检测出微小残留灶的存在。微小残留灶的检测技术包括特定的免疫组织化学染色诊断、PCR扩增和融合基因的检测(例如BCL-ABL)、重排的免疫球蛋白或T细胞受体基因和异常免疫表型的流式细胞检测等,所有患者的标本应该在移植前选择最佳的方案对其进行检测。
4 卵巢组织再移植
根据移植部位的不同,人类卵巢移植主要可以分为自体原位移植、自体异位移植及同种异体移植。原位移植是指将卵巢组织移植到卵巢窝、卵巢蒂、卵巢悬韧带,甚至卵巢内,目前绝大多数卵巢组织冷冻移植后成功生育的病例都来自原位移植。异位移植指将卵巢组织移植到腹部皮下组织、大网膜、前臂皮下、腹直肌筋膜下、肾包膜下等,2006年Oktay报道将冷冻的卵巢组织移植到患者的腹部皮下,最终获得了妊娠并且产下健康婴儿。同种异体移植是指同一动物种属内不同个体间的移植,基本上是单合子孪生姐妹间进行,通常不会引发免疫排斥反应。Donnez等报道,一名患有卵巢早衰的特纳综合征患者,在植入其同卵孪生姐妹的卵巢组织后恢复了排卵功能,7个月后患者自然妊娠并产下健康女婴。Silber等报道,10对同卵孪生姐妹患者要求进行卵巢组织移植,对其中的8例实施了新鲜或冻融卵巢组织的移植,这8例全部恢复了排卵周期和正常的血清FSH水平,其中6例自然妊娠并产下2个健康婴儿,另有3例持续妊娠中。对于移植部位的选择应考虑以下几个因素:易于手术操作、移植部位有丰富的血供、便于监测卵泡和卵子收集,还要考虑移植组织的大小。如果移植后患者想尝试自然妊娠,只能选择原位移植。移植成功的决定性因素是移植组织血供的维持,因为丰富的血供对减小移植后组织的缺血性损伤非常重要,而缺血性损伤是卵泡丢失的主要原因。卵巢组织在卵巢或盆腔腹膜下进行的原位移植与在皮下进行的异位移植相比,原位移植效果更好。Demeestere等研究发现原位移植能够获得更多的卵泡,而异位移植的卵泡发育减少,获卵率和受精率均降低。大多数(包括卵巢组织冷冻前接受过化疗的)患者移植后卵巢功能都能够恢复并维持若干年,然而,高龄患者的卵巢功能持续时间较短,目前已有研究者尝试找到促进移植后血管再生、缩短缺血时间、减少损伤的有效方法,主要有生长因子、维生素E、抗氧化剂、激素支持等干预措施。Friedman等把复苏的人卵巢组织异种移植到免疫缺陷小鼠体内观察移植组织存活及细胞凋亡情况,研究发现移植前在含有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和维生素E的培养基中处理的卵巢组织细胞凋亡显著降低,存活情况明显改善。
5 问题与展望
女性癌症患者因为要马上进入放疗和/或化疗而面临着丧失生育力的威胁,卵巢组织冷冻移植技术为这些患者带来了巨大的希望。对于这些女性,应该在在放疗和/或化疗产生的不育或致畸作用前进行卵巢组织冷冻。未来需要不断优化卵巢冷冻和移植的方案。同时,非常有必要提高微小残余病灶的检出率,来确保恶变细胞不再被移植回患者体内。一个不容忽视的事实是卵巢组织移植重建的卵巢功能似乎只能持续一个短暂的时间,然而,通过该技术已经获得妊娠和出生的结果表明当前的女性患者拥有了更多的治疗选择,特别是青春期女性不能够选择IVF激素刺激而延缓癌症治疗。此外,还应注意卵巢冷冻对患者年龄的限制,对于高龄的女性不适合进行卵巢冷冻,有研究者建议接受卵巢冷冻治疗的患者年龄不宜超过35岁。有研究者将卵巢组织冷冻与未成熟卵母细胞的体外成熟培养(in vitro maturation, IVM)结合,也就是在冷冻前先把卵巢组织中的未成熟卵母细胞收集起来进行IVM,然后直接将成熟培养后的卵母细胞进行冷冻,或者将培养成熟的卵母细胞进行卵胞质内单精子注射(introcytoplasmic sperm injection, ICSI),最后把形成的胚胎冷冻保存。这将为女性癌症患者特别是年轻的女性患者提供更多的选择机会,提高生育力保存的效率,卵巢组织冷冻与辅助生殖技术相结合也是当前的一个研究热点。也有研究者尝试将卵泡从卵巢组织中分离,再进行卵泡的体外培养或直接移植到受体,这样也可以避免卵巢组织移植时将恶性细胞再移植回受体。目前已经研发出基于水凝胶、泡沫或天然聚合物的新型培养基,这可能适合分离卵泡的体外生长,并能够在移植到病人之前形成一种人工卵巢,进行体外培养或再移植,这将使具有卵巢转移风险的患者受益。尽管该技术的研究已经取得了一定的进步,但在应用于临床之前,仍需要更深入的基础研究来证实其安全性。美国生殖医学协会于2013年提出的研究意见指出,卵巢组织冷冻移植尚处于实验性阶段,不应实施于良性肿瘤患者或者延迟生育的患者,该技术对于马上要进行放疗和/或化疗的女性患者是一种可选的治疗方案,而对于青春期前女性是唯一的选择。人类卵巢组织冷冻保存的形式有皮质活检物、皮质条或整个卵巢,目前仅有皮质条的原位移植获得了妊娠和活产,而数据显示妊娠有可能来自于原有卵巢的排卵,还没有冻融卵巢组织异位移植或者全卵巢冻融后再移植获得妊娠的报道。卵巢组织冷冻移植过程复杂,涉及的技术环节比较多,从标本的获取与处理,到卵巢组织的冷冻复苏,冷冻前后的检测,再到卵巢组织移植等每一个环节都有待技术上的不断完善与优化,这样才能够最终提高卵巢组织冷冻移植的效率,更好的为患者提供治疗。
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