印记基因H19和SNRPN CpG位点甲基化状态与精液参数的关联研究
文章导读:选取2014年4至9月于空军总医院男科就诊的符合纳入排除标准的205例男性为研究对象,采用焦磷酸测序法定量分析H19和SNRPN基因的各CpG位点的甲基化状态,采用典型相关分析印记基因H19和SNRPN的各CpG位点的甲基化水平与精液参数两组变量的整体相关性。结果:H19基因的CpG2和CpG3甲基化水平与精子密度和精子活动力的相关性具统计学意义;SNRPN基因的CpG5、CpG6、CpG7甲基化水平与精子正常形态率的相关性具统计学意义。 |
常规精液分析包括精子密度、精子正常活动力、精子活动率、精子正常形态率、Y染色体结构和核型分析等。虽然精液分析方法快速简便,但这些参数的分析结果具有较大变异性,在预测男性生育能力方面存在局限性。因此,探究能更好地反映精子功能的分子标志物成为新近的研究热点。印记基因是通过甲基化印记控制区(Imprinting Control Region, ICR),也称差异甲基化区(Differentially Methylated Region, DMR)来调控其基因的表达或抑制。在正常精子发生期间,印记基因的表观遗传标记,如DNA甲基化,在原始生殖细胞阶段擦除,在精原细胞形成阶段重建,在减数分裂和后续的精子细胞分化阶段维持。如果在印记的擦除、重建或维持任何阶段出现错误均会导致印记紊乱相关疾病。H19为定位于染色体11p15.5的父系印记基因。小核核糖核蛋白多肽N基因 (Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide N, SNRPN)为定位于15q11.3的母系印记基因。虽已有关于印记基因H19和SNRPN的平均甲基化水平与精液参数和男性不育相关性的研究,但尚缺乏关于该印记基因的各个CpG位点的甲基化水平与精液参数相关性的报道。本研究旨在通过分析分别位于印记基因H19和SNRPN 印记控制区的各CpG位点的甲基化水平与精液参数的关联,探寻反映男性精子质量及其生育能力的分子生物标志物,为男性不育的病因学、治疗及辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)的合理运用提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究采用流行病学横断面调查的方法,选取2014年4至9月于空军总医院男科中心诊治的205例男性为研究对象。排除染色体异常、Y染色体微缺失、患有精索静脉曲张尿路感染、射精异常、隐睾症、有家族性遗传病、性功能障碍以及服用影响精子生成或生育能力药物者。所有受试者均签署了知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 问卷调查 包括一般人口学特征、吸烟、饮酒、强热、化学物质、放射性物质、强噪音接触史、疾病史及用药史等。现场调查人员进行统一培训。
1.2.2 精液采集 研究对象禁欲3~7d后,手淫法取精,并记录确切的禁欲时间。
1.2.3 精液分析 待精液37℃完全液化后,由空军总医院生殖医学中心专业技师进行精液分析,依据《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检查手册》(第四版)的标准,采用WLJY-9000伟力彩色精子质量分析系统对精液进行检测,采用改良巴氏染色方法染色并阅片。
1.2.4 精子DNA提取 完全液化的精液在3h内用双层Percoll液(90% Percoll液和45% Percoll液)梯度离心25min,然后去除上层精浆和中层液,留取下层精子层。离心管内加入2mL 1×PBS离心10min,离心后取上清液,再次加入2mL 1×PBS后离心,留取下层沉淀。向离心管内加入10μL蛋白酶K和10μL二硫苏糖醇,56℃保温1h。然后加入400μL消化缓冲液(即10Mm Tris-HCl;0.1% 十二烷基磺酸钠;0.5% N-十二烷酰肌氨酸),56℃过夜。再分别用预冷的无水乙醇、70%乙醇洗涤1次。待乙醇完全挥发后加入50μ LTE缓冲液。使用NanoDrop2000c分光光度计(Thermo公司,G666,美国)测定精子DNA的浓度和纯度,DNA样品-80℃保存备用。
1.2.5 亚硫酸氢盐处理及目的 片段PCR扩增亚硫酸氢盐处理 采用EpiTect Fast DNA Bisulfite kit(50)试剂盒(Qiagen公司,151012340,德国),根据试剂盒操作指南进行亚硫酸氢盐修饰,处理液终体积为15μL,-20℃保存备用。目的片段的PCR扩增采用 PyroMark PCR kit 试剂盒(Qiagen公司,148050586,德国),参照试剂盒说明书进行。PCR反应体积为50μL,其中Pyromark PCR Master Mix(2×) 25μL,CoralLoad Concentrate(10×) 5μL,25Mm MgCl2 1μL,PrimerA/PrimerB 2.5μL/2.5μL,RNase-free water14μL。反应条件为95℃预变性15min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共45个循环,最后72℃延伸10min。所有引物由生工生物工程公司(Sangon Biotech,上海)合成。引物序列分别为H19:Forward:GGTATTTTTGGAGGTTTTTTTT;Reverse:ATATCCTATTCCCAAATAACCC;SNRPN:Forward:TTAGGTTGTTTTTTGAGAGAAG;Reverse:CCTACACTACRACAAACAAAC。
1.2.6 焦磷酸测序 检测DNA甲基化状态①单链模板制备:取50μL PCR产物,加入47μL Binding Buffer和3μL Sepharoe Beads,室温下水平震荡混匀10min。然后在Vacuum Prep Tool中依次加入180μL 超纯水、180μL 70%乙醇、180μL Washing Buffer和120μL Denaturation Buffer,被固定于磁珠上的PCR产物先在70%乙醇中洗涤10s,再在Denaturation Buffer中变性10s,最后在1×Washing Buffer中洗涤10s,得到纯净的单链DNA模板。②测序引物杂交:将结合单链PCR产物的磁珠转入45μL含有0.3μM测序引物的Annealing Buffer中,80℃放置3min。③采用PSQ96焦磷酸测序仪(Biotage公司,60-0000000428S2,瑞典)及Pyro Gold Reagents试剂盒(Qiagen公司,151010298,德国),按仪器与试剂盒说明书进行测序,检测H19和SNRPN基因印记控制区各CpG位点的甲基化水平。
1.3 统计学方法
采用IBM SPSS21.0,GraphPad Prism5.0, SAS9.4和R3.3.2软件进行统计学分析。计量资料经Kolmogorov-Smirnov检验若服从正态分布,则采用(x±s)表示。印记基因H19和SNRPN各CpG位点间甲基化水平的相互关系采用内相关分析。印记基因H19和SNRPN CpG位点甲基化水平与精液参数的关联采用偏相关分析。采用典型相关分别分析印记基因H19和SNRPN CpG位点甲基化水平与精液参数两组变量的整体相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 研究对象的一般特征
本研究共纳入205例男性,年龄(31.75±3.45)岁。精子密度为(87.33±50.03)×106/m,低于WHO标准(精子密度大于20×106/mL)的有48例(占23.41%);精子活动力为(52.20±16.29)%,低于WHO标准(前向a+b级精子大于50%)的为52例(占25.37%);精子正常形态率为(15.89±5.52)%,低于WHO标准(精子正常形态率大于15%)的为55例(占26.83%)。
2.2 印记基因H19和SNRPN各CpG位点间甲基化水平的内相关分析
印记基因H19各CpG位点间甲基化水平的相关性分析结果:相关系数r大于0.8占0%(0/120);相关系数r在0.5~0.8之间占16.7%(20/120);相关系数r在0.3~0.5之间占40% (48/120);相关系数r小于0.3占43.3%(52/120)。印记基因SNRPN各CpG位点间甲基化水平间的相关性分析结果:相关系数r大于0.8占0%(0/120);相关系数r在0.5~0.8之间占3.33%(4/120);相关系数r在0.3~0.5之间占13.33% (16/120);相关系数r小于0.3占83.33%(100/120)。
2.3 印记基因H19和SNRPN印记控制区各CpG位点甲基化水平的分布
与H19基因的平均甲基化水平(84.54%±9.95%)相比,低于平均甲基化水平的位点有CpG4(63.20%±9.08%), CpG5(63.75%±11.05%), CpG11(78.05%±10.10%)和CpG13(72.35%±8.10%)。见图2 (a)。与SNRPN基因的平均甲基化水平(7.52%±2.30%)相比,高于平均甲基化水平的位点有CpG1(10.06%±3.61%), CpG2(9.87%±5.37%), CpG3(10.51%±2.33%),CpG5(9.38%±5.08%), CpG7(7.81%±2.77%),CpG11(8.65%±5.18%)和CpG14(10.06%±3.91%), CpG15(8.99%±3.74%)。
2.3 印记基因H19和SNRPN印记控制区各CpG位点甲基化水平与精液参数的相关性
在印记基因H19中,CpG2、CpG4、CpG6、CpG8和CpG12-16位点的甲基化水平与精子密度呈正相关(r分别为0.267、0.309、0.293、0.601、0.488、0.478、0.564、0.389、0.291,P<0.001); CpG1-3、CpG5、CpG9-11和CpG16位点的甲基化水平与精子活动率呈正相关(r分别为0.338、0.328、0.477、0.344、0.333、0.432、0.389、0.272,P<0.001);CpG1-3、CpG5、CpG9-11和CpG16位点的甲基化水平与精子活动力呈正相关(r分别为0.346、0.358、0.509、0.338、0.351、 0.450、0.404、 0.292,P<0.001);CpG2-3, CpG5-6, CpG11-12和CpG14-16位点的甲基化水平与精子正常形态率呈负相关(r分别为-0.305、-0.401、-0.257、-0.400、-0.319、-0.256、-0.256、-0.314、0.296,P<0.001)。CpG2、CpG3、CpG6、CpG11和CpG16位点的甲基化水平与4个精液参数均相关,相关系数绝对值介于0.145~0.509之间。
2.4 印记基因H19和SNRPN各CpG位点甲基化水平与精液参数间的典型相关分析
H19基因的典型相关分析共得到4对典型相关变量,其典型相关系数分别为0.760(F=5.85,P<0.001)、0.702(F=3.63,P<0.001)、0.232(F=0.61,P=0.942)和0.183(F=0.50,P=0.922),前两对典型相关变量具有统计学意义。第一典型变量中,CpG2的载荷值最大,为0.389;精子密度的载荷值最大,为0.907。表明该基因的CpG位点甲基化水平与精液参数两组分之间呈整体正相关。
SNRPN基因的典型相关分析共得到四对典型相关变量,其典型相关系数分别为0.739(F=4.96,P<0.001)、0.589(F=2.90,P<0.001)、0.317(F=1.43,P=0.075)和0.305(F=1.48,P=0.127),前两对典型相关变量具有统计学意义。第一典型变量中, CpG7的载荷值最大,为0.637;精子正常形态率的载荷值最大,为-0.884。表明该基因的CpG位点甲基化水平与精液参数两组分之间呈整体负相关。
3 讨论
本研究通过分析印记基因各CpG位点间甲基化水平的内相关性,发现印记基因H19的各CpG位点间甲基化水平的相关系数r在0.3~0.8之间占56.7%,低于0.3的占43.3%,呈中或低等程度的相关;印记基因SNRPN的各CpG位点间甲基化水平的相关系数r在0.3~0.8之间占16.66%,低于0.3的占83.34%,呈低等程度的相关。鉴于印记基因H19和SNRPN 各CpG位点间甲基化水平的相关性较低,因此本研究分别分析印记基因各个CpG位点的甲基化水平与精液参数的相关性,以探讨各个CpG对于男性生育能力的影响,揭示男性不育的表观遗传学病因。本研究首次采用典型相关法分析CpG位点甲基化状态与精液参数的关联,即通过降维的方法将甲基化位点作为一组变量,将精液参数作为一组变量,再分别找出两组变量中贡献最大并与另一组变量关联系数最大的指标作为代表性的指标。印记基因H19的CpG2位点的甲基化水平与精子密度的相关性具统计学意义;印记基因SNRPN的CpG7位点的甲基化水平与精子正常形态率的相关性具统计学意义。表明印记基因H19和SNRPN印记控制区特定CpG位点的甲基化状态与精液参数有关联。筛选出具代表性的这些CpG位点,将有助于从分子水平解释男性生育能力,有助于阐明男性不育的病因。本研究也进一步证实了印记基因CpG位点的甲基化状态与男性生育力有关。已有研究表明亲本印记基因的印记改变会遗传给后代,印记基因H19微缺失和母系等位基因的甲基化异常,可能与贝克威思-威德曼综合症(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)有关;H19基因的异常低甲基化与银罗素综合征(Silver-Russell Syndrome, SRS)、胎儿宫内发育迟缓及产后低出生体重有关;SNRPN基因的印记控制区甲基化的改变与普-威综合征(Prader-Willi Syndrome,PWS)和安吉尔曼综合征(Angelman Syndrome, AS)有关。这些研究均为分析印记基因H19和SNRPN的平均甲基化水平与铺助生殖结局的关联。而本研究进一步发现特定CpG位点甲基化的状态与精子参数相关,可用作反映精子质量的潜在分子标志物,进而可为体外受精(In-Vitro Fertilization, IVF)和胞浆内单精子显微注射(Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI)等辅助生殖方法的安全性评估提供依据。综上所述,本研究采用高通量的焦磷酸测序方法,定量分析基因的甲基化水平,快速、准确,检测结果稳定。但存在样本量较小的局限性,研究结果还有待在大样本的前瞻性的研究中进一步验证。
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