苍柏湿毒清对解脲支原体感染小鼠白三烯C4的影响
文章导读:采用小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇预处理法,将解脲支原体接种于小鼠阴道,给予不同剂量苍柏湿毒清、苍柏湿毒清拆方灌胃干预,采用ELASA法检测小鼠阴道黏膜LTC4水平。结果:感染解脲支原体后小鼠LTC4水平升高,但与空白组小鼠差异不大(P>0.05)。结论:苍柏湿毒清可能不是通过调节LTC4水平而治疗阴道感染解脲支原体引起的疾病。 |
支原体是引起人类非淋病性尿道炎(NGU)、睾丸炎、附睾炎、宫颈炎、盆腔炎、不孕不育等疾病的主要病原菌之一。近年来,由支原体引起的泌尿生殖道感染有逐渐增多的趋势,其中女性感染率明显高于男性,解脲支原体(Uu)感染率高于人型支原体(Mh)感染率。解脲支原体分为14个血清型,研究发现其中血清1型、血清3型、血清4型、血清8型可能和生殖道炎症关系密切。本研究采用实验方法,探讨苍柏湿毒清及其拆方对血清4型解脲支原体感染的BALB/c小鼠阴道黏膜LTC4的影响。
1 实验材料
1.1 实验动物
雌性BALB/c小鼠,7周龄,体重(18±2g),清洁级,购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号:SCXK(京)2012-0001],饲养于北京中医药大学东方医院实验中心动物实验室。
1.2 实验菌株
解脲支原体血清4型(ATCC27816),购自ATCC(美国模式培养物集存库)。复苏并传代至第三代时配制成105CCU/mL的浓度备用。
1.3 试剂及仪器
解脲支原体液体培养基[粤食药监械(准)字2012第2400212号],购于珠海丽珠试剂有限公司。苯甲酸雌二醇(国药准字:H12020529),购于天津金耀氨基酸有限公司。小鼠白三烯C4 (LTC4)试剂盒,规格:96T,美国R&D公司。精密试纸,购自上海三爱思试剂有限公司。生化培养箱,购自重庆四达实验仪器厂。切片机RM2016,购自德国徕卡。酶标仪MULTISKAN MK3,购自Thermo。
1.4 药物组成
1.4.1 中药组成 苍柏湿毒清,草药购自北京中医药大学东方医院草药房,由北京中医药大学东方医院制剂室制备成浓缩药液。
苍柏湿毒清组药物由炒苍术、黄柏、生薏苡仁、生黄芪、苦参、茯苓、白扁豆、白头翁、马齿苋、马鞭草、丹参等组成。
活血利湿组由丹参、败酱草、虎杖等药物组成。
清热解毒组由黄柏、土茯苓、白头翁、马齿苋、白花蛇舌草等药物组成。
健脾利湿组由苍术、生薏苡仁、黄芪、茯苓等药物组成。
A组、D组、H组、I组、J组、K组;a组、d组、h组、i组、j组、k组用药量按成人6倍计算。B组、E组;b组、e组用药量按成人12倍计算。
1.4.2 生理盐水 0.9%氯化钠注射液(国药准字H11021190),购于华润双鹤药业股份有限公司。
为减小因灌胃产生的影响,设立不同剂量生理盐水灌胃组。即:c1、c2、f1、f2组每次灌入生理盐水量分别等同于a、b、d、e组每次灌入中药剂量。
2 实验方法
2.1 实验一
2.1.1 第一批
2.1.1.1 动物分组 将70只BALB/c小鼠按随机数字表随机分为A组(低剂量中药预防组)、B组(高剂量中药预防组)、C组(预防模型组)、D组(低剂量中药治疗组)、E组(高剂量中药治疗组)、F组(治疗模型组)、G组(空白组),每组10只。
2.1.1.2 操作 予A组、B组小鼠中药灌胃,2次/d,灌胃间隔6h,连续7d;C组不进行药物干预。7d后对A组、B组、C组建立模型。模型建立选用采用雌二醇预处理法。
对D组、E组、F组BALB/c小鼠建立模型,造模完成后予D组、E组BALB/c小鼠中药灌胃,2次/d,灌胃间隔6h,连续7d。
G组只给予清洁级饲料喂养,不参造模及药物干预。
2.1.2 第二批
2.1.2.1 动物分组 将BALB/c小鼠应用CDAS2.0软件包随机分组。a组(低剂量中药预防组),12只;b组(高剂量中药预防组),12只;c1组(低剂量预防模型组),10只;c2组(高剂量预防模型组),10只;d组(低剂量中药治疗组),12只;e组(高剂量中药治疗组),12只;f1组(低剂量治疗模型组),10只;f2组(高剂量治疗模型组),10只;g组(空白组),10只。
2.1.2.2 操作 予a组、b组、c1组、c2组小鼠药物灌胃,2次/d,灌胃间隔6h,连续7d。7d后对a组、b组、c1组、c2组建立模型。
对d组、e组、f1组、f2组BALB/c小鼠建立模型,造模完成后予d组、e组、f1组、f2组BALB/c小鼠中药灌胃,2次/d,灌胃间隔6h,连续7d。
g组只给予清洁级饲料喂养。
2.2 实验二
2.2.1 动物分组 首先为60只BALB/c按随机数字表随机分成6组,即H组(全方组)、I组(活血利湿组)、J组(清热解毒组)、K组(健脾利湿组)、L组(模型组)、M组(空白组),每组均10只。
M组予清洁级饲料喂养,不进行任何干预。
2.2.2 操作步骤 对H组、I组、J组、K组、L组BALB/c小鼠建立模型,造模成功后予H组、I组、J组、K组中药灌胃2次/d,连续7d。H组予全方组中药灌胃;I组予活血利湿组中药灌胃;J组予清热解毒组中药灌胃;K组予健脾利湿组中药灌胃。
2.3 样品检测
采用ELISA法对小鼠阴道黏膜进行LTC4的定量检测。实验结束2d后,对小鼠进行阴道黏膜LTC4检测。小鼠采用脱颈法处死后,用解剖刀和剪,解剖得到完整的阴道组织,取内侧黏膜组织,按照离心、稀释、加样、配液、洗涤、终止、测定、计算等步骤,得出单位蛋白浓度中所含LTC4浓度。
2.4 数据处理
应用SPSS 20.0统计软件,P<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1 实验一
3.1.1 第一批
对各组数据进行Shapiro-Wilk正态性检验,绘制阴道黏膜LTC4值的标准Q-Q图时发现C-7、F-1、F-5、G-3值严重偏离曲线,故剔除。A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组的P值分别是0.845、0.100、0.716、0.077、0.549、0.334、0.079,均服从正态分布。
各组数据进行方差齐性检验,Levene统计量为3.156,P为0.011,认为7组方差不齐。
采用Tamhane检验法,E组、F组、G组、H组、I组、J组、K组组间两两比较,P值均>0.05,差异无统计学意义。
3.1.2 第二批
对各组数据进行Shapiro-Wilk正态性检验,绘制BALB/c小鼠阴道黏膜LTC4值的标准Q-Q图时发现f2组f2-11值为122.167严重偏离曲线,故剔除。a组、b组、c1组、c2组、d组、e组、f1组、f2组、g组的P值分别是0.920、0.255、0.910、0.169、0.574、0.781、0.181、0.185、0.080,均服从正态分布。
各组数据进行方差齐性检验,Levene统计量为3.447,P为0.002,认为九组方差不齐。采用Tamhane检验法,a组、b组、c1组、c2组、d组、e组、f1组、f2组、g组,组间两两比较,P值均>0.05,差异无统计学意义。
3.2 实验二
各组数据进行Shapiro-Wilk正态性检验,H组、I组、J组、K组、L组、M组的P值分别是0.257、0.109、0.231、0.737、0.627、0.144,均服从正态分布。
各组数据进行方差齐性检验,Levene统计量为2.908,P为0.023,认为6组方差不齐。
采用Tamhane检验法,L组与M组组间比较P值为0.032,差异有统计学意义。余各组组间两两比较,P值均>0.05,差异无统计学意义。
4 实验结论
感染解脲支原体后,模型组LTC4值虽高于空白组LTC4值,但苍柏湿毒清干预组、治疗组,及其拆方后的活血利湿组、清热解毒组、健脾利湿组与模型组、空白组有差异,但差异不显著。提示:苍柏湿毒清治疗解脲支原体感染引起的疾病可能不是通过调控LTC4水平达到的。
5 讨论
Uu是引起女性阴道炎、宫颈炎主要病原体之一,临床表现为白带增多、阴道及外阴刺激瘙痒,时有尿急、尿频、排尿困难。妇科检查可见宫颈充血、水肿,触之易出血,宫颈口可见黏液脓性分泌物。Uu感染所致的泌尿生殖道感染在中医古籍中虽未有明确的记载,但根据其所致疾病的症状,将女性生殖道Uu感染归属于中医的“带下病”、“阴痒”、“淋证”等范畴。带下一词首见于《黄帝内经·素问·骨空论篇第六十》,“任脉为病,男子内结七疝,女子带下瘕聚”。《女科证治约旨》中对带下病的描述为:“若外感六淫,……不能约束诸脉经,于是阴中有物,淋漓下降,绵绵不断,即所谓带下也”。阴痒病名首载于东晋·葛洪所著的《肘后备急方》,其中不仅提出阴痒的表现,同时认为阴痒是由虫邪引起的,“若苦痒搔之,痛闷。取猪肝炙热,纳阴中,当有虫着肝”。淋证始载于《黄帝内经》,汉·张仲景在《金匮要略》中对淋证进行了描述:“淋之为病,小便如粟状,小腹弦急,痛引脐中”。
中医认为引起带下病的主要病因是湿邪,如《傅青主女科》说:“夫带下俱是湿症”。引起阴痒的主要病因是虫邪,如《诸病源候论》中记载:“妇人阴痒,是虫蚀所为”。《诸病源候论》将淋证分为气、热、石、膏、劳五淋,根据临床表现,应归为热淋。故解脲支原体引起的泌尿生殖道感染为湿、热、虫邪由外侵袭人体,湿热日久损伤脾气,致湿热下注,脾气亏虚,治当清热解毒,益气健脾。久病入络,当以活血。苍柏湿毒清治疗脾虚湿毒型解脲支原体性尿道(宫颈)炎的疗效显著,其具有抑制Uu生长、繁殖;改善阴道理化环境;消除尿道、宫颈炎症,缓解临床症状等多种作用,解除了不少患者的痛苦。全方以苍术、黄柏为君药,达到清热解毒,燥湿的目的;以生黄芪、生苡仁、茯苓等为臣药,益气健脾,帮助君药提高正气,以驱邪外出;以苦参、白花蛇舌草等为佐药,燥湿杀虫,佐以君药达到杀虫止痒之功;丹参为使药,可活血通络,驱除络脉中的瘀血。本方攻补兼施, 扶正祛邪, 标本兼顾。
白三烯(LTs)来源于白细胞,是一种重要的前炎症介质,参与多种疾病的发生、发展。细胞膜、核膜的脂质双分子层在磷脂酶A2作用下产生花生四烯酸(AA)。AA经5-酯氧酶代谢合成为白三烯A4(LTA4),在白三烯A4水解酶、白三烯C4合成酶等酶的作用下分别转化为白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)和白三烯E4(LTE4)。其中LTC4、LTD4和LTE4化学结构均含有一个硫醚连接的肽,故统称为半胱氨酰白三烯(CysLTs)。LTs参与哮喘发病的多个环节,它可以促进炎症细胞聚集,引起气道平滑肌收缩,气管通透性增加,促进粘膜分泌渗出;它还可以引起气道高反应性和气道重塑。LTC4是由β1和β2整合素与内皮细胞表面结合刺激嗜酸性粒细胞分泌的。LTC4可快速增加内皮细胞中Ca2+浓度,相同于组胺和缓激肽的100倍;还可促进培养的人黑素细胞进行有丝分裂。经研究发现LTC4参与多种疾病的过程,如患有哮喘、湿疹、特应性皮炎、慢阻肺等疾病的患者外周血中的LTC4均高于正常人。本实验对BALB/c小鼠进行解脲支原体模型建立,建立成功后模型组白三烯C4水平高于空白组;应用中药苍柏湿毒清干预、治疗,与模型组、空白组均差异不大。可以得出结论:LTC4在Uu引起的阴道炎、宫颈炎等炎症过程可能未发挥明显作用;苍柏湿毒清可能不是通过调节LTC4水平而治疗Uu引起的泌尿生殖道感染疾病。
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