不同中医治法对功能性勃起功能障碍模型大鼠eNOS mRNA、Cx43 mRNA表达的影响
文章导读:选取经交配后证实有正常勃起功能的雄性SD大鼠50只,随机分为空白组、模型组、补血活血法组、疏肝理气法组、疏肝理气活血法组,共五组,每组10只,采用尾部放血和悬吊激惹方法配合低铁饮食制备肝郁血虚勃起功能障碍模型,造模的第1d开始,在悬吊结束后1h,养血法组、疏肝法组与疏肝养血法组分别给予灌胃四物汤煎剂3.75g/kg、逍遥散煎剂9.22g/kg、四物汤与逍遥散合方煎剂12.96g/kg,空白组、模型组给予灌胃等体积生理盐水,1次/d,连续14d,末次灌胃24h后处死大鼠,取阴茎海绵体组织,HE染色观察阴茎海绵体组织病理学,PCR观察阴茎海绵体eNOS mRNA、Cx43 mRNA。结果:各组阴茎海绵体组织病理学改变均不明显;与空白组相比,模型组阴茎平滑肌组织Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达明显较低(P<0.05);与模型组相比,疏肝理气活血法组能显著提高阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达(P<0.05),疏肝理气法组可显著提高阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA的表达(P<0.05),补血活血法组阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达无统计学意义(P>0.05)。 |
男性勃起功能是影响性生活质量的重要因素。研究显示,大约有52%的40~70岁男性存在不同程度的勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED),而这个比例在老龄人群中更高,到2025年还会加倍,不和谐的性生活严重影响着家庭和睦和社会稳定。传统医学认为男性勃起多与肾有关,故治疗也多从肾论证,但目前效果不尽如人意。我们前期临床实践表明,ED患者大多表现为肝肾功能失调,从肝论治多获良效。实验证明,肝郁气滞血瘀可致阴茎海绵体组织中磷酸二酯酶5(PDE5)活性增强、一氧化氮合成酶(eNOS)活性下降,导致男性ED,而疏肝理气活血法方药能逆转这一过程,改善病情,但对具体机制尚未研究。故本课题从中医“肝藏血、主疏泄”藏象理论入手,观察不同治法方药对功能性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌组织、缝隙链接蛋白Cx43及eNOS活性的影响,论证肝与阴茎勃起的关系。
1 实验材料
1.1 实验动物
2.5月龄性成熟SD大鼠75只,体重370~420g,雄性50只,雌性25只,由成都达硕生物科技有限公司提供,质量合格证号:scxk(川)2013-24。每只雄性大鼠均经交配后证实有正常勃起功能。实验期间饲养于室温(20±3.0)℃,相对湿度60%~70%,光照12h:12h(光:暗),自由摄食全价大颗粒饲料,饮水,适应性驯养1周后使用。
1.2 主要试剂与设备
二甲苯(成都科龙化工试剂厂,批号:20120813);甲醛(成都市联合化工试剂厂,批号:201210101);异丙醇(成都科龙化工试剂有限公司,批号:120913);CX43(博奥森生物技术有限公司,货号:北京bs-8987R);RT-PCR扩增仪(美国ThermoFisher仪器有限公司,型号PIKORed96)。微摄像系统(麦克奥迪公司,Motic BA400)图像分析系统(Media Cybernetics Inc.Image-Pro Plus)。
1.3 实验药物
白术、茯苓、柴胡、当归、白芍、甘草、生姜、薄荷、熟地和川芎等中药材均购自成都同仁堂药店,经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定,各药材均符合《中国药典》(2010版 第一部)药品相关项目检查。四物汤、逍遥散参照方剂学教材\[8\]确定剂量,四物汤药物组成与剂量如下:熟地12g、当归9g、川芎6g、白芍9g;逍遥散药物组成与剂量如下:柴胡15g、当归15g、白术15g、白芍15g、茯苓15g、炙甘草7.5g、生姜3g、薄荷3g。四物汤与逍遥散合方根据上述剂量加合。分别按上述剂量配比称取四物汤、逍遥散及合方的药材,置于容器中,加8倍量水,浸泡30min后,煎煮30min,过滤,共煎2次,合并滤液,60℃水浴浓缩为1∶1(即药液含原生药1g/mL)药液,4℃冰箱保存备用。
2 方法
2.1 实验分组
选取雄性SD大鼠50只,数字表法随机分为模型组、补血活血法组、疏肝理气法组、疏肝理气活血法组和空白组,每组10只。
2.2 造模及给药
除空白组外,其余各组动物参照文献方法,采用尾部放血和悬吊激惹方法配合低铁饮食制备肝郁血虚模型。具体操作方法如下:75%酒精消毒尾部后,手术刀在尾部横向割开约3mm创口,挤压放血2mL/只,常规消毒创面并包扎,隔2d1次,连续5次。放血后休息2h(当天如果没有被动失血操作,则直接进行悬吊激惹),将大鼠尾部绑缚在固定物上,使其悬空倒吊于20cm 深,温度为(20±2)℃的水面上,以大鼠前肢刚接触水面为每只大鼠适宜的悬吊高度。同时用小木棍激惹大鼠,使其极度紧张与恐慌,而又无法发泄。悬吊激惹1次/d,连续14d,每次30min,以后每2d增加10min。各处理组大鼠从造模第1d到第15d均饲喂低铁饲料(配方:玉米淀粉54%,奶粉40%,豆油5%,食盐1%)。造模的第1d开始,在悬吊结束后1h,根据动物与人体间的等效剂量换算,补血活血法组、疏肝理气法组与疏肝理气活血法组动物分别给予灌胃四物汤煎剂3.75g/kg、逍遥散煎剂9.22g/kg、四物汤与逍遥散合方煎剂12.96g/kg,1次/d,连续14d。空白组、模型组给予灌胃等体积生理盐水,1次/d,连续14d。
2.3 取材及检测指标
末次给药24h后,脱颈椎处死大鼠,解剖出阴茎组织,并将其立即置于冰上,快速分离大鼠的阴茎海绵体组织,在冰冷生理盐水中洗净残留血液后,阴茎前半部分装于已灭活RNA酶的微型离心管,置液氮中冻存,余下组织置入10%中性甲醛中固定供制作光镜标本。阴茎海绵体组织病理学观察:大鼠阴茎勃起功能监测后,将四组大鼠断颈处死,快速分离阴茎海绵体组织后置入10%中性甲醛中,常规HE染色。Cx43mRNA、eNOS mRNA检测:大鼠脱颈椎处死,快速分离大鼠的阴茎海绵体组织,装于已灭活RNA酶的微型离心管中,置液氮中冻存。CX43:上游引物5’- AGAGTCGCATTGGGTGAA -3’,下游引物5’- GATAGAAGCCGTTTGGTG -3’,480 bp。GAPDH,上游引物5’- TCCCTCAAGATTGTCAGCAA -3’,下游引物5’- AGATCCACAACGATACATT -3’,306bp。PCR反应程序:热启动及预变性:95℃30s40个循环。变性:95℃5s退火:55℃30s充分延伸:72℃30s采集荧光。熔解曲线分析,55℃起始,80个循环,每循环温度增加0.5℃,直到95℃。反应结束后,使用Sequence Detection soft wareversion12.3 软件分析PCR过程各检测样本的CT(Threshold cycle)值。
2.4 统计学分析
所有数据均用SPSS13.0软件包进行处理,各项指标结果用均数±标准差(x±s)表示,各组数据先进行正态分布检验,组间比较用两组独立样本的t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 阴茎海绵体组织病理学观察
正常平滑肌纤维呈长梭形,无横纹,平滑肌纤维可单独存在,绝大部分是成束或成层分布的。各组大鼠平滑肌阴茎海绵体病理切片HE染色后置于光镜下观察,结果发现各组形态学改变不明显。
3.2 Cx43 mRNA、 eNOS mRNA
与空白组相比,模型组阴茎平滑肌组织Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达明显较低(P<0.05);与模型组相比,疏肝理气活血法组能显著提高阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达(P<0.05),疏肝理气法组可显著提高阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA的表达(P<0.05),补血活血法组阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达无统计学意义(P>0.05)。
4 讨论
中医理论认为肝与勃起关系密切,《沈氏尊生书》说:“失志之人,抑郁伤肝,肝木不能疏泄,亦致阳痿不起”。中医藏象理论认为“肝藏血,主疏泄”,《灵枢·经脉》曰:“肝者,筋之合也;筋者,聚于阴器”。 肝血充盈,疏泄有度,经脉通利,宗筋得以濡养,筋力强健,运动灵活有力,用事之时使阴器涨大充盈,若情志功能障碍,肝气郁结,疏泄失度,血不达筋,则影响宗筋功能的正常发挥,从而导致阳痿。王氏在20世纪80年代初提出“阳痿从肝论治”理论,对中医治疗阳痿产生较大影响。肝郁、血虚血瘀是“阳痿”的基本病理基础,疏肝理气、补血活血是中医从肝论治本病的基本法则。前期研究证明,肝郁气滞血瘀可致阴茎海绵体组织中磷酸二酯酶5(PDE5)活性增强、一氧化氮合成酶(eNOS)活性下降,而疏肝理气活血法方药能逆转这一过程,改善病情。现代研究发现,缝隙链接(Gap junction,GJ)是细胞之间的主要通讯方式之一,阴茎海绵体平滑肌中含有大量缝隙链接蛋白Cx43,在海绵体收缩与舒张的协调性过程中起着关键作用,调节海绵体的舒缩,参与阴茎勃起的调控。NO是一种强有力的平滑肌舒张因子,而eNOS是生成NO的关键酶之一,研究发现eNOS存在于大鼠动脉内皮细胞和阴茎海绵体平滑肌细胞中,任何导致eNOS活性降低的因素均可成为ED的发病基础。本研究选择疏肝理气、补血活血、疏肝理气活血3种治法方药进行研究,分别以其代表方逍遥散、四物汤及逍遥散合四物汤为研究对象,观察各种治法方药对模型大鼠阴茎海绵体eNOS mRNA、Cx43 mRNA表达的影响。研究发现各组阴茎海绵体组织病理学改变均不明显,表明肝郁、血虚血瘀尚未造成模型大鼠器质性病变,而主要是平滑肌功能的异常。与空白组相比,模型组阴茎平滑肌组织Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达明显较低(P<0.05),表明大鼠肝郁、血虚血瘀能够明显降低其阴茎平滑肌组织Cx43和eNOS 蛋白活性,提示造模成功。与模型组相比,疏肝理气活血组能显著提高模型大鼠阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达(P<0.05),表明疏肝理气活血方药能够提高模型大鼠阴茎平滑肌组织Cx43和eNOS 蛋白活性,提示对大鼠肝郁、血虚血瘀证具有疗效。疏肝理气法组可显著提高模型大鼠阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA的表达(P<0.05),表明疏肝理气方药能够提高模型大鼠阴茎平滑肌组织Cx43蛋白活性,提示对大鼠肝郁、血虚血瘀证具有疗效。补血活血法组模型大鼠阴茎平滑肌组织中Cx43 mRNA、eNOS mRNA表达无统计学意义(P>0.05),表明补血活血方药不能提高模型大鼠阴茎平滑肌组织Cx43和eNOS 蛋白活性,提示对大鼠肝郁、血虚血瘀证治疗无效。
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