精子DNA单双链损伤与精子浓度的关系研究
文章导读:研究对象为120例男性不育患者,年龄25~40岁之间,根据世界卫生标准进行精液常规检测分析精子的浓度、活力等,利用双尾彗星试验分析精子DNA单双链损伤指数。结果:120例男性不育患者根据精子浓度分为三个研究组,即组1(精子浓度<10×106mL-1)、 组2(精子浓度<20×106mL-1)和组3(精子浓度>20×106mL-1),每组40例。三组之间年龄、精子活力及精子畸形率没有统计学差异;组1精子DNA损伤指数(DFI)为(59.48±15.21)%,单链损伤指数(SSB-DFI)为(25.86±11.86)%,SSB占所有损伤精子的比率(SSB-DFI/DFI)为(43.31±13.72)%,双链损伤指数(DSB-DFI)为(31.93±10.21)%,DSB占所有损伤精子的比率(DSB-DFI/DFI)为(53.85±10.27)%;组2精子DNA损伤指数(DFI)为(34.02±1.77)%,单链损伤指数(SSB-DFI)为(26.71±3.45)%,SSB占所有损伤精子的比率(SSB-DFI/DFI)为(78.59±9.78)%,双链损伤指数(DSB-DFI)为(8.37±3.04)%,DSB占所有损伤精子的比率(DSB-DFI/DFI)为(21.40±9.79)%;组3精子DNA损伤指数(DFI)为(20.77±2.43)%,单链损伤指数(SSB-DFI)为(20.44±2.39)%,SSB占所有损伤精子的比率(SSB-DFI/DFI)为(98.44±2.87)%,双链损伤指数(DSB-DFI)为(1.32±0.61)%,DSB占所有损伤精子的比率(DSB-DFI/DFI)为(1.55±2.87)%。三组间SSB-DFI无显著差异(P>0.05),SSB-DFI/DFI在组1、组2和组3间随精子浓度升高而逐渐升高(P<0.05),DSB-DFI随精子浓度升高而逐渐下降(P<0.05),DSB-DFI/DFI随精子浓度升高而逐渐下降(P<0.05)。精子SSB- DFI及SSB-DFI/DFI与其他精液常规参数均无相关关系(P>0.05),精子DSB-DFI 及DSB-DFI/DFI与精子浓度呈负相关(P<0.05)。 |
男性不育是指夫妻双方同居1年以上,性生活正常未采取任何避孕措施,因男方原因而导致的不育。男性不育是亟待解决的医学难题,精液常规分析是评价男性精液质量的重要检查,主要分析了精子的浓度、活力及精子畸形率,其中精子浓度低是临床常见的导致不育的原因。据文献报道,有生育能力的男性精子较不育男性DNA双链损伤的明显偏低,且多数是DNA 的单链受损,双链损伤可能才是男性不育的真正原因。本研究通过双尾彗星试验鉴别精子DNA单双链损伤,探讨精子DNA损伤类型与精液浓度的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集2015年1月至2015年12月来宁波市中医院男性科就诊的不育患者341例,年龄25~45(27.9±6.7)岁,病程3~14(4.3±2.1)年,身体健康,夫妻性生活正常,未采取任何避孕措施,女方均经妇科检查、输卵管通畅实验以及B超、内分泌测定等排除女方不孕因素,排除存在感染及其他系统性疾病。依据精子浓度从中挑选120例作为研究对象,分三个研究组:即组1(精子浓度<10×106/mL)、 组2(精子浓度<20×106/mL)和组3(精子浓度>20×106/mL),每组40例。上述各组在年龄结构、身体基础等方面采用One-Way ANOVA检验比较均无差异,所有对象均签署知情同意书并经医院伦理委员会同意。
1.2 标本采集
研究对象采精前禁欲1周,洁净双手,用手淫法采取一次性全部排出的精液,将精液置于无菌容器中,在放置到37℃恒温箱中液化。待液化完全后,进行精液常规检测。
1.3 试剂和仪器
WLJY-9000型伟力彩色精子质量分析系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司);OlympusBX41型荧光显微镜;电泳槽;普通熔点琼脂糖凝胶;低熔点琼脂糖凝胶;去离子水;PBS缓冲液;裂解液1(0.4mol/LTris-HCl,0.8mol/LDTT,1%SDS,pH7.5);裂解液2(0.4mol/L Tris-HCl,2mol/L NaCl,1%SDS,0.05% EDTA,pH7.5);TBE缓冲液(TBE:0.09mol/L Tris,0.002mol/L EDTA-Na2,pH7.5);碱性电泳缓冲液(1mmol/L EDTA-Na2,300mmol/L NaOH,pH13);70%乙醇;90%乙醇;100%乙醇;中和缓冲液(0.4mol/L Tris-HCl,pH7.5);荧光染料SYBRGreenⅠ。
1.4 方法
1.4.1 精液常规分析
参考WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)要求,将液化后的精液用计算机辅助系统进行精液常规分析,测定精液量、pH、精子浓度、精子活力、精子前向运动百分比等。
1.4.2 双尾彗星实验
实验原理:双尾彗星实验又称单细胞凝胶电泳(SCGE),据文献报道,细胞核基质中附着有DNA超螺旋结构,细胞和液化的琼脂糖凝胶混匀后被铺在载玻片上,将玻片浸入细胞裂解液使其细胞膜、核膜、蛋白质等成分进入裂解扩散到溶液中,DNA双螺旋结构仍保留。当DNA未被损伤时,经电泳后大分子DNA保存于核基质,经荧光染料染色后观测,图像为圆形的荧光团。在中性电泳中(pH=7.5)若有DNA双链已发生断裂,凝胶内的DNA碎片会在电泳时向阳极迁移,呈现X轴彗星拖尾。DNA双螺旋在碱性溶液中(pH=13)可解旋双链裂变为单链,玻片旋转90°置于碱性电泳液中,电泳时若DNA有单链损伤其碎片会向阳极迁移,单链碎片产生越多或其分子量越小在电场力作用下拖尾就越长,荧光染色后呈现Y轴彗星拖尾。因此,通过测定试验中拖尾的方向和尾长就可以判定精子DNA的单双链损伤类型。实验方法:依据文献,首先制备细胞凝胶(普通熔点琼脂糖与去离子水按1∶10000混匀后溶解),将溶解的凝胶铺于未用的载波片上,晾干备用。液化后的精液用PBS缓冲液将精子浓度稀释至1×106/mL,吸取30μL精子稀释液和50μL液化状态的低熔点琼脂糖凝胶混匀,取30μL混合物铺于载波片上并加好盖玻片冻存入冰箱,冰箱温度调节为4℃。5min后将其取出并取下盖玻片再先后放入裂解液1和裂解液2中分别避光裂解30min,再用去离子水清洗5min。把玻片置入预冷的TBE电泳缓冲液避光静置解旋20min。先将电泳槽中倒入预冷的4℃TBE电泳缓冲液,并将电泳时的电压设置为25V,电流设置为25mA,电泳时间为20min,然后将玻片竖向放入并进行电泳。中性电泳后再将玻片在避光条件下浸入4℃碱性电泳缓冲液中10min,将电泳槽中倒入碱性电泳缓冲液并设置好电泳条件,电压25V,电流300mA,电泳时间20min,再将玻片旋转90°放入电泳槽内进行电泳。电泳后将玻片放入中和缓冲液,将其置于4℃冰箱5min。之后玻片浸入100%乙醇中5min,使其脱水干燥。将SYB GreenⅠ和TBE按3∶10000的比例混合配置后放入37℃水浴箱中10min,使染料充分溶解。之后用其对玻片进行染色,在把玻片置于避光环境下30min,用荧光显微镜(10×40)观测计数200个精子,再用CASP软件分析统计精子DNA单双链损伤的个数并计算出各自的损伤百分比,每个标本计数两次取平均值。结果判断与计算:依据文献报道,根据彗星托尾长度分为:无损伤(尾长小于10μm)、单链(SSB)损伤(彗星托尾位于Y轴,尾长大于10μm)、双链(DSB)损伤(彗星托尾位于X轴,尾长大于10μm)。精子DNA损伤指数等同于DNA碎片化指数(DFI)计算方法为DFI(%)=DNA损伤精子数/被观察精子总数×100%。DNA单链损伤指数用SSB-DFI表示,计算方法为SSB-DFI(%)=SSB精子数/被观察精子总数×100%。DNA双链损伤指数用DSB-DFI表示,计算方法为DSB-DFI(%)=DSB精子数/被观察精子总数×100%。DNA双链损伤精子占DNA损伤精子的比率用DSB-DFI/DFI表示,计算方法为DSB-DFI/DFI(%)=DSB-DFI/总DFI×100%,DNA单链损伤精子占DNA损伤精子的比率用SSB-DFI/DFI表示,计算方法为SSB-DFI/DFI(%)=SSB-DFI/总DFI×100%。
1.5 统计学分析
采用SPSS19.0软件进行数据分析。精子浓度、前向运动百分比、畸形率、存活率及精子DNA碎片化指数均符合正态分布,以用(x±s)表示;用t检验和Person相关分析对数据进行分析。
2 结果
2.1 三组之间各参数比较
三组研究对象的年龄、精子前向运动百分比、精子畸形率及SSB-DFI无统计学差异。三组间SSB-DFI/DFI水平比较,组1低于组2(P<0.05),组2低于组3(P<0.05);就DSB-DFI和DSB-DFI/DFI相比较,组3低于组2(P<0.05),组2低于组1(P<0.05);各组间DFI值比较,组1高于组2(P<0.05),组2高于组3(P<0.05),各组间均有显著差异。
2.2 精子DNA单双链损伤指数与精子浓度之间的相关性分析
Pearson相关分析表明,研究对象的SSB-DFI与SSB-DFI/DFI和精子浓度之间没有相关性(P均>0.05);DSB-DFI与DSB-DFI/DFI和精子浓度之间存在负相关(r分别为-0.847和-0.924,P均<0.01)。DFI与精子浓度呈负相关(r为-0.781,P<0.01)。
3 讨论
精液常规分析可以客观评价精液质量,是目前临床上评价男性生育能力的客观指标。精液分析主要评价的男性精液的浓度、活力及畸形率。精液的浓度客观反映了男性精子生成的能力,而且精子数量过少是临床常见问题。目前精液的常规分析只能得到精子的表观数据,精子数量及活力等变化受多种因素影响不能决定性的反应男性不育的根本原因。从精子DNA水平上来探讨精子质量下降的真正原因是目前研究的热点。精子DNA完整性有多种检测方法,有染色质扩散试验(SCD)、荧光原位杂交技术(FISH)等。以上这些试验都只能检测精子DNA的碎片化指数,不能区分精子DNA的损伤是单链损伤还是双链损伤。有学者认为,精子DNA的单链损伤可以通过自身修复而不对生育造成较大影响,而精子DNA的双链损伤却不能进行自身修复,因而精子DNA的双链损伤才是男性不育的真正原因。前期已有学者对双尾彗星试验进行了改良,并建立了精子DNA损伤的9种类型。为更深一步研究精子DNA单双链损伤与精子浓度及生成的关系,本实验继续对该试验进行了改良与优化,通过观察不同精子浓度精液中DNA的单双链损伤类型及指数,发现了不同浓度精液中SSB-DFI无统计学意义(P>0.05),而DSB-DFI在不同精子浓度的三组研究对象却有显著意义,组1明显高于组2和组3,组2高于组1,DSB-DFI随着精子浓度下降而逐渐升高,并且我们还发现随着精子浓度的下降DSB-DFI/DFI也逐渐升高,精子浓度正常或较高的精液中DNA损伤类型绝大部分为单链损伤。将精子浓度与DSB-DFI及DSB-DFI/DFI进行相关性分析表明,DSB-DFI和DSB-DFI/DFI与精子浓度存在负相关。DNA的复制是半保留的,只要其双螺旋结构存在,就可以进行自身修复而不会引起碱基对及密码子的丢失,而当DNA双链损伤时却难以修复。此前有研究报道,DFI值与精子浓度及存活率呈相关性,而又有学者认为精子DFI与精子存活率呈相关性,但与精子浓度并无相关。本研究发现在不育男性中,不同精子浓度的精液其DFI值也有显著差异,研究对象中组1明显高于组2和组3,而组2又高于组3,精子浓度与DFI存在负相关,当DFI越高时其精子浓度也就越低,DFI与精子活力也呈负相关。各种研究选取的研究对象及方法的差异可能是导致结果差异性较大的原因。因此,真正影响精子浓度的是精子DNA的双链损伤。精子生成受基因位点的调控,Sun等研究发现了USP9Y基因一个碱基的缺失会减少精子的生成;Kleiman等发现了当EIF1AY基因缺失时,精子发生会出现障碍,偶发无精子症。基因芯片测序是常用的基因测序手段,但由于基因芯片仅包含已报道的常见遗传变异,会造成潜在功能的低频及罕见突变被漏检。秦玉峰等对非梗阻型无精症进行高通量测序,发现了6个与精子生成障碍相关的遗传变异位点,SIRPA基因上的chr20.1902132和chr20.1902301位点,SIRPG基因rs1048055和rs2281807,SOX基因的rs11046992和rs146039840。不仅基因位点的变异和缺失会引起生精障碍,基因表达水平的变化也是重要原因之一。贺小进等对TEX15调控精子发生的机制进行研究发现,miR-183与TEX15基因存在靶向关系,可以下调TEX15基因的稳定性从而影响其转录后表达,TEX15下调会直接导致减数分裂过程遗传重组异常,最终引起精子发生障碍。精子的生成受多个基因位点的调控,DNA双链损伤所致的基因位点缺失、变异及表达水平变化,可能是导致精子浓度下降的真正原因。精子DNA单双链损伤的研究逐步进行,大多数学者认为其参考价值要优于精子核DNA碎片化指数。但双尾彗星试验由于操作要求较高,缺乏质量控制,其结果依靠主观判读,因而临床应用有阻力,其方法仍待优化和简练。
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