囊胚和卵裂期胚胎玻璃化冷冻解冻移植周期的妊娠结果分析
文章导读:回顾分析2014年1月至2014年12月在我院生殖医学中心行玻璃化冷冻解冻移植周期388个患者的妊娠情况,其中囊胚冷冻解冻165个移植周期(A组),卵裂期胚胎冷冻解冻223个移植周期(B组)。结果: A组和B组解冻存活率分别98.76%和96.74%,两组间无统计学差异(P>0.05);临床妊娠率、种植率和单胎率A组(68.48%、57.38%和76.10%)显著高于B组(68.48%、57.38%和59.37%);多胎率、双胎率和三胎率A组(23.01%、22.12%和0.88%)显著低于B组(40.62%、31.25%和9.37%,P<0.05);A组和B组的流产率分别为5.31%和6.25%,两组间无统计学差异。 |
在人类辅助生殖技术中,胚胎冷冻保存技术是其中的重要环节之一,患者新鲜胚胎移植后剩余胚胎需冷冻保存;还有患者新鲜周期需全胚冷冻保存,例如中重度卵巢过度刺激综合症、宫腔积液、子宫内膜异常和激素水平欠佳的患者等,必须推迟胚胎移植时间。胚胎冷冻保存技术为这部分不孕患者提供了一种选择方案。目前,玻璃化冷冻技术已用于人类卵子和早期胚胎的冷冻,该技术已经有几种不同的方法被采用,Kuwayama报道使玻璃化冷冻液体积达到最小化的载体名为Cryotop是一种高效保存人类卵子的方法。本文使用这种方法玻璃化冷冻人类囊胚和卵裂期胚胎,比较囊胚和卵裂期胚胎冷冻复苏后移植的复苏率、妊娠率和着床率,取得了较好效果。
1 资料与方法
1.1 研究对象
2014年1月至2014年12月,在本中心接受治疗的165个玻璃化冷冻—复苏囊胚移植周期,其中常规IVF 128例,卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)37例;女方年龄25~38岁,平均年龄(30.32±4.25)岁;不孕时间2~10年,平均(5±3.22)年;不孕原因为:输卵管因素81例、男方因素34例、多囊卵巢综合症(PCOS)35例、其他因素15例。同时期进行了223个玻璃化冷冻—复苏卵裂期胚胎移植周期,其中常规IVF166例,ICSI57例;女方年龄23~40岁,平均年龄为(30.87±4.71)岁;不孕时间1~12年,平均为(5±3.38)年;不孕原因为:输卵管因素106例、男方因素52例、多囊卵巢综合症51例、其他因素14例。两组患者的平均年龄、不孕时间和不孕原因比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 研究方法
1.2.1 促排卵方案 两组患者均于前个月经周期的21d开始用达必佳针剂(德国辉凌公司)0.05mg/d垂体降调节,于月经周期的4d开始用果那芬(FSH,瑞士雪兰诺公司)和绝经期促性腺激素(HMG,珠海丽珠公司)超促排卵,当B超监测直径达18mm的卵泡超过3个时,当晚注射绒毛膜促性腺激素(HCG,瑞士雪兰诺公司)5000~10000IU,36h后经阴道B超引导下穿刺取卵。
1.2.2 精液的处理 采用Isolate(Irvine Scientific,美国)梯度离心、G-IVF Plus授精液(vitrolife,瑞典)上游法处理精液。
1.2.3 体外受精与胚胎培养 培养使用含6% CO2、5%O2的37℃培养箱,获得的卵子放入G-IVF Plus授精液中,培养2~5h后行常规IVF或ICSI授精,授精后18~20h转入G-1 Plus卵裂培养液(vitrolife,瑞典)中,观察受精即2原核为正常受精,第3d观察胚胎分裂情况即常规评估胚胎。除选择2~3个优质胚胎进行移植外, A组为剩余胚胎转入G-2 Plus囊胚培养液(Vitrolife,瑞典)中培养至第5d或第6d观察囊胚形成情况,根据Gardner囊胚评分系统形成的囊胚进行评分, 评分4AA、4BB、4AB、4BA的囊胚视为优质囊胚并将其玻璃化冷冻;B组为第3d移植后剩余优质胚胎在当天进行玻璃化冷冻。
1.2.4 玻璃化冷冻与复苏 囊胚和卵裂期胚胎冷冻及解冻采用玻璃化法(Kitazato 日本),冷冻液和解冻液均为日本Kitazato公司产品。冷冻方法:冷冻液分为ES(equilibration solution,平衡液)和VS(vitrification solution,冷冻液),使用前从4℃冰箱中取出置室温23~26℃平衡30min。在室温下将胚胎移至ES液中平衡(囊胚10 min,卵裂期胚胎6 min),移至VS液中平衡不超过60s,并快速以最小的液滴体积将胚胎放到Cryotop(Kitazato Cryotop package,日本)的前端,浸入液氮,每支载体Cryotop装载1~3个胚胎。解冻方法:解冻液分为TS(Thawing solution,复苏液),DS(diluent solution,稀释液),WS1(washing solution1,洗涤液1)和WS2(washing solution2,洗涤液2)。使用前将TS液在37℃平衡30 min,其他解冻液在23~26℃室温平衡30 min。每次解冻1~3个胚胎,将载体Crytop从液氮中取出,迅速将尖端浸入到37℃的TS液中,将胚胎在TS液中反复洗涤1min,移至DS液中放置3min,移至WS1液和WS2液中各放置5min。最后移至G-2 Plus囊胚培养液中置于含6% CO2、5%O2的37℃培养箱内培养待移植。
1.2.5 胚胎移植 患者新鲜周期胚胎移植未妊娠, 采用自然周期或激素替代周期行解冻囊胚或卵裂期胚胎移植,阴道B超引导下完成胚胎移植,囊胚或卵裂期胚胎根据不同情况移植数为1~3个,妊娠标准是胚胎移植后14d为生化妊娠,临床妊娠为4周后B超观察到妊娠囊和胎心搏动。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0软件进行数据录入处理,运用方差分析和χ2检验比较各组数据,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
两组中患者年龄、不孕时间、授精方法、不孕原因比较均无统计学差异(P>0.05)。
2.2 冻融胚胎及临床结果比较
两组玻璃化冷冻胚胎复苏存活率比较无统计学差异(P>0.05);A组移植胚胎数显著少于B组,但临床妊娠率、种植率和单胎率显著高于B组,多胎率、双胎率和三胎率显著低于B组,且胚胎移植数多导致B组多胎率、双胎率和三胎率较高,两组间有统计学差异(P<0.05);两组流产率无统计学差异(P>0.05)。
3 讨论
玻璃化冷冻技术是将细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速率,过冷到所谓“玻璃化转变温度”,而被固化成完全的玻璃态,并以这种玻璃态在低温下保存,避免了冰晶的形成,从而减少冰晶对细胞的冷冻损伤,达到冷冻保护的作用。增加冷冻保护剂浓度和提高降温速率是成功进行玻璃化冷冻的重要因素,在冷冻操作过程中同时做到这两点,选择合适的冷冻承载工具即载体很关键,借助载体进行玻璃化冷冻可以有效减少冷冻保护液的体积,提高冷冻速率,从而降低冷冻液的毒性及冷冻过程中的损伤。玻璃化冷冻使用的载体形式多样,主要有:普通麦管(Straw),开放式拉细麦管(OPS),封闭式拉细麦管(CPS)法,电镜铜网(EMG),最小容量(MVC)和冷冻环(Cryoloop)等,目前,很多研究均采用Cryotop 做人卵母细胞玻璃化冷冻,取得较为满意的结果,该方法将细胞装载的冷冻保护剂减少到了极限,降低了冷冻保护剂对细胞造成的损伤。因此,合理的玻璃化冷冻承载工具是成功进行玻璃化冷冻的重要因素之一。本研究使用Cryotop做玻璃化冷载体,该方法可使承载胚胎的玻璃化溶液终体积低于1μL,装载液体量极少,冷冻时胚胎与液氮直接接触,冷冻速率达到-23000℃/min,可能更有利于在冷冻过程中形成玻璃化状态从而提高存活率避免了冰晶形成,而且可将渗透性CPA 的浓度降低30%,极大地减弱了毒性效应,无论是卵囊胎还是胚裂期胚的玻璃化冷冻,均能获得较高的复苏存活率。在冷冻过程中囊胚在冷冻液中脱水和皱缩速度明显比卵裂期胚胎慢,特别是扩张期囊胚,囊胚腔内含有大量液体,更容易在冷冻过程中形成冰晶造成损伤。Van Landuyt等囊胚冷冻前未进行人工皱缩,扩张期囊胚存活率低于早期囊胚。冷冻前对囊胚腔进行了人工皱缩,可明显改善冷冻效果,本研究采用激光辅助孵化技术,冷冻前先用激光将扩张期囊胚人工皱缩,然后再玻璃化冷冻,获得了321/325(98.76%)的复苏存活率。近年来,卵裂期胚胎和囊胚玻璃化冷冻在临床上广泛应用。孙迎利等比较卵裂期胚胎和囊胚的复苏率、植入率和妊娠率均无统计学差异。张顺吉等研究表明卵裂期胚胎和囊胚期胚胎复苏率无统计学差异, 但是囊胚冷冻能获得较高的着床率和妊娠率。本研究显示囊胚冻融移植获得113/165(68.48)的临床妊娠率和140/321(43.61)的种植率,明显较卵裂期胚胎高,这可能是由于IVF/ICSI周期中早期胚胎发育阻滞现象,发育潜能差或染色体异常的胚胎在未发育至囊胚时会停止发育,只有潜在发育能力好的胚胎才能发育至囊胚\[9\];在自然生理情况下,早期卵裂的胚胎处于输卵管中,胚胎只有发育到囊胚期后才会逐渐迁移到子宫腔内着床,理论上,直接移植囊胚到子宫腔内更符合自然规律,更接近于人的生理状态,具有更好的胚胎发育和子宫内膜的同步性以及子宫内膜容受性,临床研究表明胚胎种植成功及临床妊娠的关键是良好的种植环境,子宫内膜容受性是胚胎的着床及妊娠的关键之一;另外,囊胚冻融过程存在一定的退化率,有研究表明,发育潜能较低、胚胎评分较差的囊胚可能经过冷冻-复苏之后不能实现再次扩张,囊胚复苏能淘汰掉一部分发育潜能不佳的囊胚;囊胚是有潜在发育能力好的卵裂期胚胎发育而来,经过了胚胎基因组的激活,囊胚的形成在形态上经历了细胞融合、囊胚腔形成及囊胚腔扩张的变化, 基因调控上经历了由母型调节向胚胎型调节的转化,具有更好的发育潜能。因此,本研究认为正是由于囊胚冻融移植具有更好的胚胎发育和子宫内膜的同步性、子宫内膜容受性、囊胚具有更好的发育潜能以及冻融过程本身能淘汰一部分发育潜能不佳的囊胚,与卵裂期胚胎冻融移植相比能够获得更好的临床妊娠结果。同时囊胚冻融移植比卵裂期胚胎冻融移植减少了每个周期胚胎移植的数目,多胎率也明显减少,说明囊胚冻融移植可以降低多胎妊娠的发生率。而且囊胚玻璃化冷冻可以提高每个促排卵周期的累积妊娠率。但是,双囊胚移植仍然会导致患者发生双胎妊娠,给孕妇和胎儿的健康带来一些风险。已有国外的IVF中心尝试进行单囊胚移植,有效的避免了多囊胚移植导致的多胎妊娠,值得我们借鉴。本文分析结果表明,采用Cryotop玻璃化冷冻技术冻融卵裂期胚胎和囊胚可以获得较高的存活率、临床妊娠率和种植率,并且囊胚冻融可以获得更满意的临床妊娠结果,值得在临床上应用推广。
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