性别相关的母血中游离胎儿DNA的Y染色体微缺失筛查的探索研究
文章导读:留取16~20孕周进行唐氏筛查的孕妇血标本,提取出全血基因组DNA后利用AZF基因特异性引物进行多重PCR,跑胶检测实验结果。结果:妊娠女性胎儿的孕妇血浆DNA用AZF基因特异性引物没有扩增出特异性条带,而妊娠男性胎儿的孕妇血浆DNA用AZF基因特异性引物能够扩增出特异性条带。结论:通过提取孕妇血浆中的DNA能够检测到游离胎儿DNA,并能通过多重PCR鉴定出胎儿是否为AZF基因缺失,从而提前预测胎儿今后罹患无精子症的风险。 |
出生缺陷是影响出生人口素质的重要问题,为了提高人口素质,产前筛查和产前诊断在国家的大力宣传与督促下已经越来多的受到关注和研究。近年来随着分子生物学等技术的发展, 从孕妇外周血检测胎儿游离DNA为无创性产前诊断和妊娠并发症的筛查开辟了新途径, 具有应用范围广、易被广大患者接受的优点。AZF基因微缺失与严重的生精功能障碍密切相关,属于遗传缺陷,可以通过自身遗传和辅助生育技术传递给下一代,目前主要是针对成年男性进行检测,而之前不育的问题会困扰患者很长时间并花费高额的医疗费用,如果能够在胎儿时期就检测出AZF缺陷,在患者成长过程中就能够对症治疗,节省大量的医疗成本和患者精力。本文是通过AZF基因特异性引物对孕妇血浆中DNA 进行多重PCR检测胎儿Y染色体AZF基因的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本 留取2012年7月至2012年9月孕龄在16~20周,年龄18~42岁,经B超检查均为单胎,本院妇产科门诊送检来本生殖中心做唐氏筛查的健康孕妇血浆,分装于EP管中,冻存于20℃冰箱中保存。筛查阳性的结果标本弃之,通过后期的随访随机选取9例男胎、5例女胎的孕妇血浆标本。样品收集遵循的程序符合十堰市人民医院医学伦理委员会所制定的伦理学标准并得到该委员会的批准,同时取得了受试对象的知情同意。
1.1.2 Y染色体微缺失试剂盒 深圳亚能生物公司出产的试剂盒。
1.2 方法
1.2.1 外周血血浆样本制备及DNA提取 在1.5mL 离心管中加入800μL裂红液及100μL抗凝全血,充分混匀,室温放置2~3min,8000rpm离心2min,弃去上清,小心保留管底沉淀。加入10μL变性液A和250μL充分摇匀的变性液B,充分混匀,室温放置5min,8000rpm离心5s,弃去上清,将离心管倒置在吸水纸上片刻,小心保留管底沉淀。向沉淀中加800μL洗涤液I,漩涡振荡器上充分悬浮沉淀,8000rpm离心5s,小心弃去上清,将离心管倒置在吸水纸上片刻,小心保留管底沉淀。向沉淀中加800μL洗涤液II,漩涡振荡器上充分悬浮沉淀,8000rpm离心5s,小心弃去上清,将离心管倒置在吸水纸上片刻,小心保留管底沉淀。向沉淀中加800μL无水乙醇,漩涡振荡器上充分悬浮沉淀,8000rpm离心5s,小心弃去上清,将离心管倒置在吸水纸上片刻,小心保留管底沉淀。沉淀置于干燥仪中60℃干燥约10min,当沉淀完全干燥成白色粉末后加入100μL溶解液并混匀,60℃保温10min,8000rpm离心5s,上清作为PCR模板。琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA提取结果,各取3μL上清上样,取3μLDL2000作为marker,浓度为50ng/μL。
1.2.2 PCR扩增反应体系设计 15对PCR引物扩增覆盖所有AZF区域的15个STS序列标签,其中AZFa有3个序列标签,AZFb有6个序列标签,AZFc有4个序列标签。同时设计一对PCR引物扩增SRY基因,作为内控。从试剂盒中取出PCR反应液管I、II、III、IV各21管,取出正常男性DNA,均置于室温融化,5000rpm离心2s。取待检样品1μL,用纯水补足体积25μL。50℃预热10min;95℃预变性15 min;94℃ 30s,58℃ 1 min,72℃ 1 min 进行35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
1.2.3 电泳鉴定 制备2.0%琼脂糖凝胶,取10μL PCR产物加入上样孔进行电泳。恒压120V电泳约20min,取出凝胶在凝胶成像分析系统中观察结果。
2 结果
2.1 外周血全基因组DNA提取
电泳结果显示14例样本的孕妇外周血全基因组DNA提取成功,浓度约为10~100ng/μL。
2.2 PCR电泳鉴定结果显示
9例妊娠男性胎儿的孕妇和5例妊娠女性胎儿的孕妇血浆DNA扩增有比较明显的区别,妊娠女性胎儿的孕妇血浆DNA扩增没有明显的特异性扩增序列,而妊娠男性胎儿的孕妇血浆DNA扩增可以看见显著的特异性序列。其中1、3、12、13、14号为妊娠女性胎儿的孕妇。
3 讨论
SRY检测是最早运用于母血中胎儿DNA 研究的。SRY是决定着男性特征的Y 染色体上的特异序列。LO等使用QIA ampBlood kit 提取DNA, 用实时定量PCR 测定了胎儿DNA 存在。为了提高胎儿性别的确定率, 一些学者利用套式PCR 技术敏感性提高到100%。Hondas用实时定量PCR 分析SRY 基因, 在妊娠5周后检出率为100%,我国学者任晨春等\报道对早期、中期300名孕妇外周血浆经荧光定量PCR 方法检测其中的SRY 基因, 最早在42d可检出, 在孕早期该法灵敏度为85.4%, 特异性为100%; 孕中期灵敏度, 特异性均为100%。孕妇血浆中的游离胎儿DNA因其高含量、短寿命、容易提取,成为简便、有效的胎儿基因物质来源,应用孕妇血浆中的游离胎儿DNA进行产前诊断,是目前开展无创性产前诊断的主要研究方向。以往的研究多采用荧光定量PCR的方法来检测Y染色体上的特定基因,用于性连锁遗传病男性胎儿的检出。本研究找到了一种简便的利用普通PCR即可检测出妊娠男性的孕妇,相对于以往的研究更加快速易行,并且后续可对血浆中游离男性胎儿DNA 进行Y染色体微缺失筛查的探索性研究。近年来,关于AZF微缺失的研究已经十分深入,但目前AZF微缺失的筛查在中国还未能广泛开展起来。AZF基因微缺失与严重的生精功能障碍密切相关,会导致男性特发性无精子症和重度少精子症,是男性不育的的主要原因之一,我国有较多的男性不育的无精子症、少精子症患者,可能存在Y染色体AZF区域微缺失。我们在孕妇孕期就提出对其进行一个早期的遗传缺陷筛查,为现今每一对只生育一个孩子的夫妇提供遗传咨询,确保下一代的健康。诊断AZF微缺失,为患者避免一些不必要的药物及手术治疗提供了重要的临床依据。
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