ICSI周期卵子成熟度对胚胎发育与临床结局的影响
文章导读:收集我院从2012年3月至2013年12月,新鲜周期中未成熟卵子(MⅠ或GV)占获卵数50%及以上的ICSI周期为A组(n=33); 2012年9月至12月,新鲜周期中未成熟卵子小于获卵数的20%为ICSI周期为B组(n=138)。比较两组胚胎的受精率、正常受精率、多核率、优质胚胎率、临床妊娠率和种植率。结果:A组(n=33) 获卵261枚,成熟卵子118枚;其中受精率80.51%,正常受精率72.88%,多核率6.78%,优质胚胎率47.37%,妊娠率30.30%,种植率19.30%;B组(n=138) 获卵1330枚,成熟卵子1146枚,其中受精率89.97%,正常受精率86.39%,多核率1.13%,优质胚胎率61.64%,妊娠率59.42%,种植率40.88%。A组受精率、正常受精率、临床妊娠率、种植率均显著低于B组(P<0.05),而多核率显著高于B组(P<0.05)。 |
控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)技术是以药物的手段,在可控制的范围内诱发多卵泡的发育和成熟,其目的是获取适当数量的高质量成熟卵母细胞。卵母细胞的成熟是一个复杂的过程,包括胞质成熟和胞核成熟,而可利用卵子通常是指核及胞质同步成熟的卵子。COH可以使患者在同一周期产生多个成熟和不成熟卵,为研究发育程度不同的卵子提供了机会。有研究报道,细胞质和细胞核的变化对受精和早期胚胎分化发育的影响至关重要。目前,卵母细胞核成熟通常以第一极体排出作为标志,而卵母细胞质中线粒体和皮质颗粒的变化是卵母细胞质成熟的重要反映指标。促排卵过程中,同一周期内获得未成熟卵子比例过高的发生率很低,个别患者可能存在一定未知因素致卵子成熟障碍,而部分患者可能与促排卵过程有关。由于卵子的成熟度直接关系到卵子的受精、着床率及妊娠率,如何改善COH方案提高卵子质量,从而改善受精率和临床妊娠率是辅助生殖领域研究的最终目的。
本研究通过回顾性分析171个ICSI周期的患者资料,探讨卵子成熟度对胚胎发育潜能及妊娠结局的影响,为进一步提高卵子及胚胎的可利用率提供指导。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选择2012年3月至2013年12月在南京大学附属鼓楼医院生殖医学中心治疗的171个ICSI周期的患者资料进行回顾性分析。患者纳入标准:(1)年龄 ≤ 38 岁;(2)首次接受ICSI治疗;(3)采用长方案促排卵;(4)获卵数 ≥ 3枚。根据卵子成熟度进行分组:A组为2012年3月到2013年12月,未成熟卵子(MⅠ或GV)占50%及以上,并有胚胎移植的ICSI周期(n=33);B组为2012年9月到2012年12月,未成熟卵子小于获卵数的20%,并有移植胚胎的ICSI周期(n=138)。
1.2 人卵母细胞的采集与处理
应用常规促排卵方案进行卵巢刺激,B超监测卵泡生长发育。当2~3枚以上卵泡直径达18 mm 时,注射HCG 5000~10000 IU。HCG注射后34~36 h行B超引导下经阴道穿刺取卵术。获取的卵丘-卵母细胞复合物(OCCs)经Gamete(Vitrolife, Sweden) 洗涤后,转入IVF(Vitrolife, Sweden)序贯培养微滴中,于37℃/6% CO2培养箱中培养待用。
1.3 ICSI术
带卵丘放射冠的卵母细胞置IVF序贯培养液中预培养3h, 用透明质酸酶(Vitrolife, Sweden)消化颗粒细胞, 将去除颗粒细胞的卵子在倒置显微镜下观察卵子成熟情况,并置于IVF培养液中培养待ICSI用。卵母细胞按成熟度分3期:生殖泡期(GV),减数分裂中期Ⅰ(MⅠ),减数分裂中期Ⅱ(MⅡ)。预培养1h后,挑选形态相对正常的精子对成熟卵母细胞行ICSI术,注射后的卵母细胞转入G1(Vitrolife, Sweden)培养液中继续培养。
1.4 受精、卵裂的观察及胚胎的评估
16~18 h后将培养皿置于倒置显微镜下观察原核,判断是否受精;正常受精卵出现2个原核(2PN)。受精后分别于44 h及68 h在倒置显微镜下进行胚胎质量评估。
1.5 移植与妊娠判定
取卵后72h,挑选优质胚胎行B超引导下宫腔内胚胎移植术。胚胎移植后14d检测血HCG阳性,移植后4~6周B超下检查见胎心搏动判定为临床妊娠。
1.6 统计学分析
结果以均数±标准差(x±s)或率(%)表示,采用 SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析。对计量资料里有t检验和χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
两组患者的女方年龄、不孕年限、内膜厚度、获卵数、不孕原因构成(输卵管因素、排卵障碍)、临床用药方案均无显著性差异(P>0.05),两组具有可比性。
2.2 受精、胚胎发育与临床结局比较
A组受精率为80.51%,正常受精率为72.88%,均显著低于B组的89.97%和86.39%(P<0.05);A组优质胚胎率为47.37%,显著低于B组(61.64%)(P<0.05);A组临床妊娠率为30.30%,种植率为19.30%,显著低于B组59.42%和40.88%(P<0.05)。相反,A组多原核比率为6.78%,显著高于B组(1.13%)(P<0.05)。此外,B组剩余胚胎的囊胚形成率为23.95%,高于A组(16.67%),但未有统计学差异。
3 讨论
3.1 未成熟卵子过多的原因分析
较多文献报道,通过COH所募集的卵母细胞中大约有15%为未成熟的卵母细胞,其中约4%为GV卵,约11%为MI卵,这些未成熟的卵母细胞主要源自COH过程中的小卵泡。虽然促排卵IVF/ICSI周期中获得未成熟卵子过多的发生率很低,但仍应得到临床医生的足够重视。本中心近两年共出现33例患者未成熟卵比例达到获卵数的50%以上。个别患者可能是由于多囊卵巢综合征(PCOS) 或卵巢反应不良引起,部分患者可能与促排卵过程有关。Andrea等认为,对药物有高反应的患者经常产生更多的未成熟卵子, E2水平过高是否是导致卵巢刺激高反应的原因尚不明确,因此导致未成熟卵比例过高的原因还需进一步研究。
3.2 卵子成熟度与ICSI中的多精受精
ICSI术后多原核合子的发生率约为3.7%,多见于3PN,≥ 4PN极为罕见,形成率仅为0.04%。与上述结果一致,本研究结果表明,A组共有8枚形成多原核,且均为3PN合子,ICSI术后多原核合子的发生率为6.78%;对照组共有13枚多原核,且均为3PN合子,ICSI后多原核合子的发生率为1.13%。
有研究报道,ICSI术后3PN合子具有第一极体(完整或是碎片状),但无第二极体,说明第三个原核可能是未排除的第二极体形成的。第二极体未排出的原因有:(1)ICSI术分裂中期的细胞受损。(2)第一次减数分裂的纺锤体重新排布,促使染色体多极分离。多极分离产生的染色体独立形成原核, 导致多原核的发生。(3)注入精子过程中损害了细胞骨架,引起第二次减数分裂纺锤体的方向错误。(4)hCG日血清中的激素水平异常;Sachs等研究发现对药物有高反应的患者经常产生相应的更多的未成熟卵子,并以多个不成熟卵和高E2水平为标志,可能与第二极体的排出障碍有关。(5)少精、无精症患者的二倍体精子被注入卵母细胞中,而少精症患者的二倍体精子发生率约为2.2%。此外,发现3PN合子的产生可能与患者对Gn刺激的高反应有关,这种高反应可能影响了卵母细胞的质量和内部结构,在募集较多的卵细胞中,必定存在质量较差的卵子,多原核的形成可能与卵母细胞原核发育异常有关。综上所述,ICSI操作时应避免对纺锤体损伤的可能,其次缩短卵母细胞在体外的操作时间,减少温度等波动对卵母细胞纺锤体的影响。
3.3 卵子成熟度与胚胎质量及临床结局
体外受精过程中,优质卵母细胞应该是细胞核和细胞质的同步成熟。一般在显微镜下观察到卵丘细胞扩散、第一极体释放,即认为卵母细胞已达到成熟状态,实际上可能只是达到了核成熟阶段,而细胞质未必成熟。Combelle等认为,卵母细胞胞质的成熟,为细胞创造了良好的代谢环境,提供卵母细胞正常所需的能量,促使卵子正常受精,卵裂及囊胚形成。细胞质的成熟是伴随着核成熟而出现的一系列变化,而细胞完成了蛋白质的磷酸化及去磷酸化和细胞器的重新排列是胞质的成熟表现,主要包括皮质颗粒形成,蛋白质合成,透明带成熟等。只有胞核和胞质同步成熟的卵母细胞才具备良好的受精及胚胎发育的潜能。本研究结果显示,A组优质胚胎率显著低于B组,剩余胚胎的囊胚形成率低于对照组,但没有统计学差异,A组的临床妊娠率及种植率均显著低于B组。出现上述结果的原因可能是由于细胞质不成熟的卵母细胞受精后,皮质颗粒因为数量不够或者未移到皮质,使得皮质反应不全,最终导致胚胎分裂异常和着床失败等。此外,对于卵泡发育不均的患者进行研究,发现小卵泡来源的卵母细胞形成的胚胎,其染色体可以是正常的,并且可以正常发育到囊胚阶段,说明小卵泡来源的卵子也有利用价值。
3.4 对策
IVF的成功取决于夫妇双方的自身条件和IVF临床实施过程的调控,在胚胎实验室技术和环境稳定的前体下,卵母细胞的质量对临床结局的影响至关重要。卵泡发育的整个过程都受到促排卵药物的影响,大量研究报道了大剂量Gn对卵母细胞正常的减数分裂、发育潜能和表观遗传修饰的影响。Meng QX研究发现超促排卵过程会降低小鼠卵母细胞水通道蛋白3的表达以及胚胎的发育潜能;临床观察也发现未使用Gn进行促排卵的患者胚胎种植率更高。上述结果均表明,选择不合适的促排卵方案和促排卵药物会对卵母细胞的质量造成负面影响。由于各种促排卵方案各有其特点,临床选择时应该根据患者自身条件,充分评估卵巢功能,实施“方案个体化,用药多元化”的策略,使促排卵方案最优化。对于促排卵后已经出现未成熟卵子过多的患者,可以采用IVF+IVM(in-vitro maturation) 这种助孕方式,对于PCO患者,获得的未成熟卵子可以通过IVM方式获得更多的可利用胚胎。Ao A等报道了首个IVF+IVM技术结合种植前遗传学诊断技术(PGD),排除遗传风险后获得妊娠的病例。田之莹等于2008年1月报道了32个病人行IVF+IVM 30个周期,妊娠率达33.3%(10/30)。随着未成熟卵子体外培养技术的逐步成熟,IVF+IVM策略会得到更广泛的应用。
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