不同类型精子缺陷与印记基因H19甲基化水平关联性研究
文章导读:以2014年4月至2014年9月间入院诊治的男性不育患者为研究对象,排除患有精索静脉曲张、隐睾症、核型异常和Y染色体微缺失的病例,依据临床精液常规检查结果,分别筛选出特发性少精子症患者(浓度<20×106/mL,其余指标均正常)、特发性弱精子症患者(前向运动精子百分率<50%,其余指标均正常)、特发性畸形精子症患者(正常精子形态比率<15%,其余指标均正常)各25例;25例正常精液样本作为对照组。采用焦磷酸测序法定量分析各组精子DNA中H19基因印记控制区域的甲基化水平。结果:少精子症组[(75.04±15.35)%]和弱精子症组[(79.48±11.64)%]印记基因H19甲基化水平显著低于正常对照组[(89.10±11.23)%],差异均有统计学意义(P=0.006,P=0.024);畸形精子症组[(87.82±12.10)%]与正常对照组H19基因甲基化水平的差异无统计学意义(P =0.758)。 |
已有研究表明,在导致夫妻不孕不育的因素中,与男性相关的因素约占50%,且该比例还在不断上升。男性不育是一个复杂的病理过程,许多研究探索导致男性不育的遗传学因素,但只能解释其中约15%的病例。近年来,关于印记基因甲基化与男性不育的相关性受到了越来越多的关注,而少精子症、弱精子症、畸形精子症是男性不育主要的精子缺陷因素。有研究表明,印记基因H19的甲基化状态异常与精液质量下降相关,可能是男性精子缺陷形成的原因。
近年来,关于精子印记基因甲基化状态的研究不断增多,采用的方法多种多样,但大多是从定性或半定量水平进行分析,且存在试验周期长、操作复杂等缺点。本研究采用焦磷酸测序法(pyrosequencing),可同时分析96个测序样本,直接定量分析印记基因H19甲基化水平,探讨印记基因H19甲基化状态异常与不同类型精子缺陷的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取2014年4月至2014年9月间于空军总医院男科中心诊治的男性不育患者为研究对象,年龄25~35岁,排除患有精索静脉曲张、隐睾症、核型异常、Y染色体微缺失病例。病例组包括25例特发性少精症患者精液、25例特发性弱精子症患者精液、25例特发性畸形精子症患者精液,随机选取25例正常精液作为对照组,病例和对照共100例。所有研究对象均签署知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 样本采集 嘱受检者禁欲3~7d,手淫法取精。
1.2.2 精液分析 精液离体后37℃充分液化,根据《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检查手册》(第四版)的标准,采用WLJY-9000伟力彩色精子质量分析系统对精液进行检测,使用改良巴氏染色方法染色并阅片。
1.2.3 DNA提取 充分液化的精液在3h内用双层Percoll液梯度离心,离心后去除上层精浆和中层液,留取下层精子。离心管内加入2mL 1×PBS后离心,离心后取出上清液,再次加入2mL 1×PBS后离心,离心后留取下层沉淀。向离心管内加入10μL蛋白酶K和10μL二硫苏糖醇,56℃保温1h。然后加入400μL消化缓冲液,56℃过夜。在室温下,分别用无水乙醇洗涤1次、70%乙醇洗涤2次。待乙醇挥发完全后加入50μL TE,使用NanoDrop2000c分光光度计(Thermo公司,G666,美国)测定DNA的浓度和纯度,合格样本-80℃保存备用。
1.2.4 亚硫酸氢盐处理及目的片段PCR扩增 亚硫酸氢盐处理:采用EpiTect Fast DNA Bisulfite kit(50)试剂盒(Qiagen公司,151012340,德国),依据试剂盒操作指南进行亚硫酸氢盐修饰,处理液终体积为15μL,-20℃保存备用。PCR扩增:采用 PyroMark PCR kit 试剂盒(Qiagen公司,148050586,德国),参照试剂盒说明书,对目的片段进行PCR扩增,PCR反应体积为50μL,反应条件为95℃预变性15min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,45个循环;最后72℃延伸10min。然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。所有引物由生工生物工程公司合成。
1.2.5 焦磷酸测序检测H19 DNA甲基化状态 ①单链模板制备:取PCR产物50μL,加入47μL Binding Buffer和3μL Sepharoe Beads,室温下水平震荡10min。被固定于磁珠上的PCR产物先在70%乙醇中洗涤10s,再在Denaturation Buffer中变性10s,最后在1×Washing Buffer中洗涤10s,得到纯净的单链DNA模板。②测序引物杂交:将结合单链PCR产物的磁珠转入45μl含有0.3μM测序引物的Annealing Buffer中,80℃放置3min。③采用PSQ96焦磷酸测序仪(Biotage公司,60-0000000428S2,瑞典)及Pyro Gold Reagents试剂盒(Qiagen公司,151010298,德国),按仪器与试剂盒说明书进行测序,检测H19基因目的片段内甲基化位点的核苷酸频率。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计分析。均数之间的比较采用两独立样本的t检验或方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者资料统计分析
筛选出的3组精子缺陷患者(少精子症、弱精子症、畸形精子症)与正常对照组在年龄上无显著性差异(P>0.05);少精子症组与其他3组在精子浓度上有显著性差异(P<0.05);弱精子症组与其他3组在向前运动精子百分率上差异显著(P<0.05);畸形精子症组在精子正常形态率方面与其他3组有显著性差异(P<0.05)。
2.2 印记基因H19焦磷酸测序结果
测序图谱峰清晰,背景噪声较小。
本研究检测的目的片段包含16个CpG位点,其中第五个CpG位点为多态性位点(C/T),故在统计时排除。在对照组中H19基因的甲基化水平为(89.10±11.23)%,而在少精子症组、弱精子症组、畸形精子症组中分别为(75.04±15.35)%、(79.48±11.64)%、(87.82±12.10)%。少精子症组(P =0.006)和弱精子症组(P=0.024)与对照组的差异均有统计学意义,而畸形精子症组(P=0.758)与对照组的差异无统计学意义。与对照组相比,少精子症组、弱精子症组及畸形精子症组分别有13、11和3个CpG位点的甲基化水平差异有统计学意义。由于所有被检测的CpG位点均表现出了高度的个体间变异性,根据对照组中各CpG位点甲基化水平计算得到各位点的甲基化水平阈值,获得各精子缺陷组的CpG位点甲基化状态图谱。
3 讨论
甲基化属于表观遗传学范畴,是蛋白质和核酸的重要修饰方式,其与生长发育、衰老、癌症等众多疾病密切相关。近年来,有研究表明,DNA甲基化在精子发生过程中起着重要作用。自Marques等报道了印记基因的甲基化异常与精子缺陷相关后,不断有研究表明精液质量下降与印记基因的甲基化异常密切关联。
目前对DNA甲基化的检测方法主要为:甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP),是一种简便的、特异的、敏感的定性研究方法;亚硫酸氢盐处理后测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP),可直接反映基因甲基化状态,是检测甲基化的经典方法;焦磷酸测序法,可快速同时检测多个甲基化位点,对甲基化程度进行精准定量。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。在每一轮测序反应中,反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对,便释放出一个分子的焦磷酸(PPi),生成的PPi最终转化为可见光,通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰,通过检测甲基化位点的C/T(或A/G)峰高的比值,即可对基因的甲基化程度进行定量分析。焦磷酸测序技术具备同时对大量样品进行测序分析的能力,为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行甲基化分析研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。
辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)为不育男性获得后代带来了希望,但近年来的一些研究表明,通过辅助生殖技术可能产生胎儿畸形、低出生体重及妇女流产率升高等问题,此外ART与罕见印记疾病(如Beckwith-Wiedemann综合征、Silver-Russell综合征、Angelman综合征)发病率增高可能有密切的关联。其原因可能是精子印记缺陷患者通过ART把印记缺陷遗传给后代,从而使通过ART出生的婴儿患印记疾病的几率增高,而Silver-Russell综合征和Beckwith-Wiedemann综合征的发生与印记基因H19的低甲基化有密切关联。本研究中畸形精子症的患者H19基因甲基化状态与正常对照组无明显差异,故ART治疗畸形精子症患者的安全性相对较高;而少精子症组和弱精子症组与正常对照组相比差异显著,通过ART产生的后代患罕见印记疾病的危险性相对较高,但H19基因甲基化水平究竟下降到何种程度会导致通过ART出生的后代患印记疾病的几率明显升高,目前尚无定论。焦磷酸测序技术的定量分析功能可检测出每个CpG位点的甲基化水平,为划定H19基因甲基化水平的阈值提供了可能。在统计学中,与均值相比,差值在两倍标准差之外的数值为超警戒限的值,即某一CpG位点甲基化水平与正常对照组相应位点相比若差异在两倍标准差之外,可认为此位点甲基化异常。为降低或消除精子缺陷患者后代患印记疾病的风险,运用这一阈值概念,把少精子症组和弱精子症组患者的各CpG位点划分为甲基化正常位点与甲基化异常位点,将对少精子症和弱精子症患者行ART治疗具有临床指导意义。而在畸形精子症组中,观察到个别CpG位点的甲基化水平低于阈值,可视为个体差异,其H19基因的甲基化状态可认为是正常的。
综上所述,本研究所使用的甲基化检测方法可大通量、快速、定量的分析印记基因H19的甲基化水平;H19基因的甲基化异常与少精子症和弱精子症密切相关,但可能与畸形精子症无关;所得到的定量分析结果可对不同类型精子缺陷患者进行ART治疗提供一定的指导作用。但进一步大样本的其它导致男性不育的基因筛选及其表观遗传学改变仍有待深入研究,对ART的影响也需进一步探讨。
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