胚胎冷冻保存时间对FET妊娠结局的影响
文章导读:回顾性分析本中心833个解冻移植周期,按冷冻保存时间分为Ⅰ组(<90d);Ⅱ组(90~365d);Ⅲ组(366~730d);Ⅳ组(>730d),比较组间临床妊娠结局情况。结果:四组的平均年龄及平均移植胚胎数均无显著性差异,各组间的临床妊娠率无显著性差异。 |
胚胎冷冻技术目前已是人类辅助生殖技术中的一项常规技术。随着玻璃化冷冻技术的引入,冻融胚胎移植周期与新鲜移植周期的临床妊娠率已十分接近。因此,对于因获卵数多而存在卵巢过度刺激(OHSS)风险或因内膜因素不适合移植的患者而言,胚胎冷冻无疑是一个不错的选择。该技术最大的优点在于提高了胚胎的利用率,进而增加了IVF治疗周期的累计妊娠率,使得病人在一次促排卵周期中可获得多次移植胚胎的机会。正因如此,许多生殖中心全胚冷冻周期不断增加,有的生殖中心甚至有超过15年的冻存胚胎。那么,经过长时间的超低温冷冻后,胚胎还能够复苏并成功妊娠吗?为解决这个问题,本研究在本生殖中心实验室采用玻璃化冷冻/解冻流程下,旨在探讨冷冻保存时间是否会对FET妊娠结局产生影响。
1 材料与方法
1.1 研究对象
随机选择2012年1月至2014年12月在本中心行冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)的833对不孕夫妇纳入研究。选择标准:年龄<35岁,盆腔及输卵管因素不孕,冷冻的胚胎为第5d囊胚,FET的胚胎中至少有1枚为优质囊胚。
1.2 胚胎冷冻及复苏
将准备冷冻的第5d囊胚先进行辅助孵化(assisted hatching, AH),进行AH的位置在远离内细胞团处。胚胎冷冻使用Vitrification Cooling Kit(日本KITAZATO公司),冷冻液分为ES和VS,使用前必须上下颠倒晃动数次,使之均匀分布,然后将ES和VS置于室温(25℃)平衡30min。冷冻时将胚胎置于的ES表面,室温下放置,胚胎会迅速皱缩,之后会逐渐恢复,待胚胎恢复至最饱满时(约8~10min)迅速将胚胎转移至VS中反复吸吐(时间不超过30s)后装至载杆头部并吸干胚胎周围残留液体,投入液氮中。胚胎复苏使用Vitrification Thawing Kit(日本KITAZATO公司),解冻液分为TS、DS、WS-1、WS-2。使用前也应上下颠倒晃动数次,使之均匀分布,然后将TS置于37℃平衡30min,其它解冻液体于室温(25℃)平衡30min。解冻时将装有胚胎的Cryotop载杆从液氮中取出,以最快的速度将载杆插入TS中,并在显微镜下确定胚胎已从载杆上落到TS中,随后观察胚胎形态,待胚胎完全皱缩后可将胚胎转移至DS(3min)、WS-1(5min)、WS-2(5min),胚胎形态将完全恢复,然后将胚胎转入囊胚培养液中培养等待移植。
1.3 患者子宫内膜准备
均采用人工周期进行内膜准备。患者于月经第3d口服戊酸雌二醇(补佳乐,拜耳医药保健有限公司广州分公司,国药准字J20130009)2mg/d,于月经第13d开始B超监测。待内膜厚度≥8mm时开始肌注黄体酮(浙江仙琚制药股份有限公司,国药准字H33020828),于肌注黄体酮后第5d进行胚胎解冻并移植,移植后继续黄体支持。
1.4 妊娠结局的确定
胚胎移植后14d抽血检测β-HCG,若为阳性则判定为生化妊娠,需继续进行黄体支持。胚胎移植后28d进行B超,见宫内孕囊及胎心搏动者确定为临床妊娠。
2 结果
总共833对患者行冻融胚胎移植,按冷冻保存时间分成Ⅰ组(<90d);Ⅱ组(90~365d);Ⅲ组(366~730d);Ⅳ组(>730d),各组间平均年龄无显著差异(P=0.643)。共移植胚胎1652枚,各组间平均移植胚胎数无显著差异(P =0.195)。各组的临床妊娠率无显著差异(P =0.875)。
3 讨论
超低温冷冻技术早已应用于动物及人类胚胎的冷冻保存。理论上说,保存在液氮(-196℃)中的胚胎已停止了一切新陈代谢活动,只要一直保存在这样的环境下,这些“休眠中”的胚胎可以被保存成千上万年。但是理论毕竟是理论,长时间的冷冻保存到底会对胚胎造成伤害吗?最早的一篇报道是来自于Testart等的研究,其结果显示经过数月时间的冷冻后,胚胎的部分细胞会出现凋亡的现象。也有研究证实,早期胚胎的冷冻会影响核DNA以及线粒体DNA,进而影响基因的转录、表达,从而影响细胞的分裂。有学者对鼠胚的研究也发现,玻璃化冷冻会影响早期胚胎的甲基化过程。另外,冷冻过程也会导致诸如酶类失活、离子失衡以及自由基的产生等情况的发生。但是,也有学者提出相悖的结论。早在20世纪70年代,Whittingham等就提出小鼠胚胎可在低温无限期保存的可能性。Glenister等甚至将冷冻胚胎暴露在相当于2000年累计辐射量的环境下,胚胎的解冻复苏率、胚胎发育能力以及后代的繁殖能力并未受到影响,且后代发生变异的概率也未增加。Cohen等的研究也显示,胚胎的发育潜力不受冷冻保存时间的影响。Dowling-Lacey等将冷冻保存了20年的供卵体外受精形成的胚胎进行解冻移植获得了妊娠并分娩,这可能是冷冻保存时间最长的临床妊娠案例。Wilson等也对供卵胚胎冷冻/解冻移植进行了研究,结果显示长时间(最长超过5年)冷冻保存不会影响胚胎移植的临床妊娠率。Aflatoonian等对年龄超过39岁的651位患者的胚胎按照冷冻保存时间长短分组进行研究,结果显示不同冷冻保存时间各组间临床妊娠率并无显著性差异。不过值得关注的是,虽然将胚胎进行长时间的超低温冷冻保存似乎对临床妊娠结局没有什么影响,但是在冷冻前对胚胎进行的预处理还是可能对胚胎造成不利影响的。玻璃化冷冻常使用DMSO(二甲基亚砜)作为冷冻保护剂,DMSO是一种含硫有机化合物,其能够通过结合水分子,提高溶液的黏滞系数,弱化水的结晶过程而起到保护细胞的作用。但是长时间高浓度地暴露于DMSO可能对细胞产生毒性,使细胞内果糖-1,6-二磷酸酶的功能受损,并可能与蛋白质发生不可逆的结合。且高渗状态会导致蛋白质折叠错误,所产生的自由基会导致DNA双链的解聚。郑圣霞等也就玻璃化冷冻对胚胎、配子及卵巢组织安全性进行了详尽的阐述,其指出高浓度的冷冻保护液可导致胚胎细胞微粒丢失,细胞质膜破裂,线粒体改变。同时也有国外学者通过研究牛胚胎显示,无论使用何种冷冻保护剂,玻璃化冷冻/解冻过程均可导致胚胎细胞DNA碎片增加,以及多种与细胞凋亡相关的基因表达增加,进而降低胚胎的发育能力。因此,作为辅助生殖的医务工作者,我们还是应该对冷冻/解冻胚胎移植出生的婴儿进行长期的随访跟踪并进行评估。
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