单囊胚冻融周期中囊胚冷冻时期及冻融后囊胚再次扩张程度对临床结局的影响
文章导读:回顾性分析行冻融单囊胚移植的患者211例,根据冷冻时间不同分为Day 5冷冻组(n=113)和Day 6冷冻组(n=98),比较两组患者的临床妊娠率,胚胎种植率和早期流产率。根据囊胚解冻后2小时囊腔的扩张程度分为:部分扩张组(n=54)、完全扩张组(n=105)、孵出组(n=52),比较三组患者的临床妊娠率,胚胎种植率,早期流产率。结果:Day 5冷冻组的临床妊娠率(63.72%)和种植率(63.72%)均显著高于Day 6冷冻组(46.94%,46.94%)(P<0.05),Day 5冷冻组的流产率(13.89%)低于Day 6冷冻组(17.39%);冻融后部分扩张组的临床妊娠率(40.74%)和种植率(40.74%)均显著低于完全扩张组和孵出组的临床妊娠率(60.95%、61.54%)和种植率(60.95%、61.54%),三组的流产率依次递减但无统计学差异分别为(18.18%、15.63%、12.50%)。 |
近年来随着各生殖中心妊娠率的提高,多胎妊娠率也随之增高,成为现代辅助生殖技术中最常见的并发症之一。囊胚具有高着床潜能,移植单个囊胚可以获得与双囊胚移植相当的妊娠率,且明显降低双胎妊娠率。因此,国内外胚胎学家均认识到多胎妊娠的不利影响,提倡并已开展选择性单囊胚移植。自2000年Yokota 等报道囊胚玻璃化冷冻首例成功妊娠以来,囊胚玻璃化冷冻技术引起了临床工作人员越来越多的关注,并且玻璃化冷冻的囊胚复苏后可以获得令人满意的存活率及妊娠率。然而,对于冻融前囊胚质量的评判及冷冻时期的选择尚未达成统一标准,冻融后囊胚的存活状况及继续发育能力的评判也没有类似分裂期胚胎的明确标准。因此,制定冻融前后囊胚的评估标准对挑选优质囊胚,改善妊娠结局有重要意义。本文旨在探讨在由剩余胚胎培养形成的单囊胚冻融周期中,不同发育时期的囊胚冻融后对妊娠结局的影响,以及冻融后囊胚腔的再扩张程度对妊娠结局的影响。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性分析2012年10月至2014年10月,在南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心行常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET) 或卵胞浆内单精子注射( intracytoplasmic sperm injection,ICSI) 治疗的患者,患者纳入标准为女方年龄<38周岁;子宫内膜8~12mm之间,复苏剩余胚胎培养后形成的囊胚进行单囊胚移植,共211个周期。根据冷冻时间不同分为Day 5冷冻组(n=113)和Day 6冷冻组(n=98)。根据囊胚复苏后培养2h,囊胚腔的扩张程度分为三组:A组为部分扩张组(n=54);B组为完全扩张组(n=105);C组为开始孵出组(n=52)。
1.2 人卵母细胞的采集与处理
患者经常规促排卵治疗,在取卵日行B超引导下经阴道穿刺取卵术。获取的卵丘-卵母细胞复合物放入IVF (Vitrolife, Sweden)微滴中,于37℃、5% O2、6% CO2、89% N2培养箱中培养待用。
1.3 胚胎培养
采卵日为Day 0 天,经IVF/ICSI方式受精后,于16~18h将培养皿置于倒置显微镜下观察原核,判断是否受精;正常受精卵出现2个原核(2PN)。受精后分别于44 h及68 h在倒置显微镜下评估胚胎质量。移植当日(Day 3)除移植胚胎外,挑选优质胚胎行分裂期胚胎玻璃化冷冻,将其余发育潜能较差胚胎转至G2 培养液(Vitrolife, Sweden),置5% O2、6% CO2、89% N2及饱和湿度培养箱中继续培养。Day 5、Day 6 分别观察囊胚质量。
1.4 胚胎评估
采用Gardner 评分系统评估囊胚质量。囊胚复苏后继续培养2h后观察囊胚腔的形成。根据囊胚腔的重新扩张情况分为三组:A组为部分扩张组:囊胚1,2期;B组为完全扩张组:囊胚3,4期;C组为开始孵出组:囊胚5,6期。
1.5 囊胚的冷冻与复苏
1.5.1 冷冻囊胚冷冻 选择Day 5 和Day 6 囊胚在G2 培养液(Vitrolife, Sweden)30μL培养液滴内,利用激光破膜仪系统进行人工皱缩。待囊腔近乎完全皱缩后将囊胚移入基础冷冻平衡液( 添加20% SSS的HTF) 内2min,再将皱缩囊胚放至ES[含7.5%(v/v) DMSO 和7.5%( v/v) EG]平衡10min,然后移入VS[含15% (v/v) DMSO,15% (v/v) EG,和0.65mol /L sucrose]平衡60s。将胚胎装载于Cryotop上,液氮内保存。
1.5.2 复苏囊胚 复苏前,准备3mL含1mol 蔗糖的基础培养液,37℃平衡30min 以上。复苏时将Cryotop上囊胚放入1mol 蔗糖内1min,其后分别经0.5、0.25、0mol 蔗糖溶液各3min。行激光辅助孵化。将囊胚移入囊胚培养液G2(Vitrolife, Sweden) 内,在37℃、5% O2、6% CO2、89% N2及饱和湿度培养箱内培养2h后,待移植。
1.6 胚胎移植与妊娠结局的判断
解冻后1h和2h分别对解冻单囊胚在倒置显微镜下观察囊胚恢复情况,后行B超引导下宫腔内胚胎移植术。移植后2周检测血HCG,若为阳性在移植后4周B超检查,超声下见孕囊胎心判定为临床妊娠。妊娠12周内胎停发育或发生妊娠物排出则诊断为早期流产。
1.7 统计学处理
采用 SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析。对计量资料里有t检验和χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
选取符合纳入标准的周期211例,女方年龄均小于38周岁,移植日内膜厚度8~12mm。复苏囊胚218枚,复苏后211枚囊胚腔扩张,复苏存活率96.79%(211/218)。211个周期均进行了胚胎移植,B超下见到妊娠囊118个,种植率为55.92%(118/211),118例获得临床妊娠,临床妊娠率55.92%(118/211),流产18例,流产率为15.25%(18/118)。
Day 5,Day 6两组患者的平均年龄、不孕年限、体重指数(BMI)均无显著差异(P>0.05),两组患者的内膜准备方案及内膜厚度均无显著差异(P>0.05)。A,B,C三组患者的平均年龄、不孕年限、BMI无显著差异(P>0.05),三组患者的内膜准备方案及内膜厚度均无显著差异(P>0.05)。
2.2 单囊胚冷冻时期对冻融后移植的临床结局影响
Day 5冷冻组的囊胚复苏率(97.41%)略高于Day 6 冷冻组(96.08%),无统计学差异;Day 5冷冻组的临床妊娠率(63.72%)、种植率(63.72%)均显著高于Day 6 冷冻组的临床妊娠率(46.94%)、种植率(46.94%)(P<0.05);Day 6冷冻组的流产率(17.39%)高于Day 5冷冻组(13.89%),但并无统计学差异(P>0.05)。
2.3 冻融后扩张程度对临床结局的比较
A,B,C三组的囊胚复苏率分别为94.74%,98.13%,96.30%,无统计学差异;A组的临床妊娠率(40.74%)和种植率(40.74%)均显著低于B、C组的临床妊娠率(60.95%、61.54%)和种植率(60.95%、61.54%)(P<0.05),B、C组间的临床妊娠率和种植率无统计学差异(P>0.05)。三组的流产率逐渐降低但无统计学差异(P>0.05)。
3 讨论
多胎妊娠是辅助生殖技术的并发症之一,可能导致早产、低出生体重、胎儿及新生儿死亡等并发症。近年来,我国辅助生殖技术领域的多胎妊娠率已上升至约30%~40%。人类辅助生殖技术中,胚胎移植数目较多成为多胎妊娠的主要原因,而单囊胚移植在获得较理想的妊娠结局的同时可显著降低多胎妊娠。囊胚移植的优势在于可淘汰质量差的胚胎,并且使胚胎发育与子宫内膜的同步性更好,因此囊胚移植的着床率高于卵裂期胚胎。随着囊胚玻璃化冷冻技术的不断改进和成熟,囊胚复苏率、临床妊娠率、种植率获得与新鲜周期相似的结局。为获得理想的单胎妊娠,单囊胚移植已经成为必然的发展趋势。本研究对受精后第3d的剩余胚胎进行继续培养后形成的单囊胚行玻璃化冷冻,获得相对满意的结果,复苏囊胚218枚,复苏后211枚囊胚腔扩张,复苏存活率96.79%;211个周期均进行了胚胎移植,种植率为55.92%,临床妊娠率55.92%,流产率为15.25%,为选择性单囊胚移植技术的开展提供了依据。然而,对于冷冻前囊胚时期的挑选以及冻融后囊胚冷冻损伤和继续发育能力的判定,本研究结果表明,Day 5囊胚与Day 6囊胚相比,具有更好的发育潜能,解冻后可获得更好的妊娠结局;冻融后囊胚腔的扩张程度越好,其发育潜能越高,显著改善妊娠结局。
有关Day 5和Day 6囊胚的继续发育潜力并未达成共识。Richter等研究显示第5d与第6d囊胚复苏后移植,临床结局无差异,认为第6d囊胚的继续发育潜能与第5d囊胚没有差异。而另一些研究认为第6d囊胚发育潜能较差,且不易耐受冷冻,移植后着床率、妊娠率低,因而第5d的早期囊胚是最适宜冷冻的阶段。胚胎的发育速度能够影响冻融囊胚移植的结局,囊胚发育缓慢可能导致胚胎不具备最佳种植潜能。本研究对剩余胚胎培养形成的囊胚冻融后行单囊胚移植的211例周期进行回顾性分析。研究结果显示,Day 5冷冻组的临床妊娠率(63.72%)、种植率(63.72%)均显著高于Day 6 冷冻组的临床妊娠率(46.94%)、种植率(46.94%),Day 5冷冻组的流产率低于Day 6冷冻组,但无统计学差异。因而第5d形成的囊胚的种植潜能较第6d形成组更好,临床结局更优。此结果进一步提示胚胎的发育时期对临床结局有显著影响。Alfarawati等利用滋养层细胞活检对囊胚进行染色体分析,发现Day 5囊胚的非整倍体发生率较Day 6囊胚低。Kadar等的研究发现随着培养时间的延长,可能导致胚胎卵裂球DNA的损伤增加。
囊胚复苏后是否存在冻融损伤及继续发育潜能是影响冻融单囊胚移植妊娠结局的另一重要因素。囊胚的存活从形态上判断需要注意囊胚内各个细胞的细胞膜,折光性以及透明带的完整性,但最主要的判断标准要依赖于继续发育能力的判断,而继续发育能力的判断主要取决于囊胚腔的重新扩张程度。在临床工作中可以观察到最早在15min就出现囊胚腔增大的迹象,在解冻后2h观察囊胚腔的扩张程度,部分囊胚已开始孵出,部分刚充满透明带,而有一部分才刚开始扩张。冻融囊胚的质量以及冷冻损伤会影响囊胚腔的扩张程度。冻融过程可导致囊胚部分细胞死亡,使内细胞团和滋养层细胞连接不紧密,影响囊胚腔的重新形成。囊胚腔的重新扩张预示着冻融后滋养层细胞及内细胞团的重新连接,是囊胚有继续发育能力的标志之一。因此,冻融后囊胚细胞可能会失去重新扩张和继续发育的能力,最终导致囊胚凋亡,不能着床或种植后流产。
Shu等研究认为在2~4h内快速扩张组的临床妊娠率为非快速扩张组的2倍,囊胚腔的快速扩张能力预示了囊胚的较好的发育潜能。而冻融后囊胚腔再次扩张的程度是一个直观的形态学指标,当扩张缓慢时,直接预示冻融损伤干扰了细胞内外水的运输机制,并且使冻融后囊胚的生存能力低下,导致囊胚的种植能力降低,移植后流产机率增加。Ahlstrom等也有相似的研究结果,其研究了1~5h内囊胚腔的扩张情况,认为2h是一个分割点。因此,本研究在囊胚解冻后2小时对囊胚腔的扩张情况进行观察,发现完全扩张组和孵出组的临床妊娠率及种植率均显著高于部分扩张组,而且囊胚腔形成较快的完全扩张组和孵出组相比,部分扩张组有较低的流产率。综上所述,囊胚腔的重新扩张能力反应了囊胚的继续发育潜能,是囊胚具有种植能力的一个重要指标,可以作为临床冻融后挑选、评估囊胚质量的一个判断指标。
冻融后单囊胚移植是现阶段重要的辅助生殖技术手段,能有效减少因多胎增加的早产及母婴合并症等风险。本次研究的局限性在数据样本量相对较少,限制了数据分析的客观有效性。本研究结果显示,剩余胚胎培养形成的单囊胚冻融后移植仍能保持高于50%的种植率,为日后推动选择性单囊胚移植的开展提供了良好的临床依据。然而冻融后单囊胚移植仍存在一些问题,如囊胚冷冻标准的进一步细化,冻融后囊胚的继续发育潜能的其他判断指标。在未来的研究中,我们将进一步扩大样本予以验证,以确保该方法的有效性及安全性。
来自《中国性科学》杂志 转载请注明出处