生精障碍动物模型研究进展
文章导读:男性不育的发病率在近些年来呈现上升的趋势。在男性不育的患者中,很大一部分为特发性不育,大多表现为无明确病因的少精、无精子症。通过建立理想的生精障碍动物模型,有助于研究男性不育的发病机制,并为临床上的诊治提供帮助。本文对国内外学者通过不同方法建立的生精障碍动物模型进行了综述。 |
不孕不育症是一种生殖系统疾病,近些年来发病率有不断上升的趋势。现在大约有15%的生育年龄夫妇有不孕不育的问题,其中半数病例与男性不育有关。男性不育可由很多因素引起,近些年来,由于环境污染、社会压力的增大以及不健康的生活方式,平均男性精子的参数有下降的趋势并导致男性不育的发病率上升。现如今由于伦理的原因,有一部分关于男性不育的相关研究无法在人体身上开展。因此,构建出稳定、经济的生精障碍动物模型对于研究男性不育的机制十分重要。本文对近些年来对于生精障碍动物模型的构造方法进行综述如下。
1 化学方法
1.1 雷公藤多苷
在临床应用雷公藤多苷的过程中,有学者发现口服雷公藤多苷会导致男性患者精液参数降低,停药后可以恢复正常。通过将雷公藤多苷灌服大鼠,可以诱导产生与男性不育病理改变较为相似的生精障碍动物模型。马凰富等将雷公藤多苷研磨后,用去离子水新鲜配制成混悬液,对SD大鼠每日灌服1次。发现给予大鼠40 mg/(kg·d)浓度,连续灌服4周可以获得较为理想的生精障碍大鼠模型。实验组大鼠精子活动率和精子浓度显著下降,睾丸组织可观察到精原细胞和初级精母细胞显著减少。6~8周后各项指标有一定恢复,但仍与对照组有显著差异。说明该造模剂量与时间既对大鼠的生精功能有抑制作用,又不造成较大的损害,符合造模要求。
1.2 白消安
临床上白消安多用于慢性粒细胞白血病的缓解治疗,有学者发现临床上长期服用白消安治疗会影响人类的生育能力。研究表明,白消安可特异性地损伤大鼠生精干细胞和精原细胞的作用,破坏精子的产生。Panahi等首先将10mg/kg剂量的白消安注射入SD大鼠的腹腔,21d后再次腹腔注射双倍剂量的白消安,并在第2次腹腔注射后35d移除大鼠的睾丸。在实验组大鼠的睾丸中,发现只存在支持细胞和不成熟的生殖细胞,生精小管扩张,精子发生显著降低。该实验考虑到大鼠的生精周期为56d,因此可得到完全无精子症的大鼠模型。
1.3 环磷酰胺
环磷酰胺是临床上常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂,具有显著的生殖毒性,容易导致精子DNA损伤、少精症、后代畸形。Hales等研究认为其主要通过干扰DNA合成而阻碍生精细胞的有丝分裂,从而诱导睾丸生精细胞的大量凋亡。冯波等在2007年的实验,每只小鼠予腹腔注射环磷酰胺(配制成0.1%注射液)2mg/d,连续5d。末次给药后,生精细胞和间质细胞数均维持于显著低水平,提示环磷酰胺对于生精细胞的破坏作用。同时在间质细胞中检测到Bax基因的大量表达,提示环磷酰胺通过Bax基因诱导间质细胞的凋亡。该实验死亡率为16%,死亡率较低,且不需要长时间进行造模的操作,具有经济性、便捷性的优点。
1.4 腺嘌呤
腺嘌呤是诱发慢性肾衰动物模型的常用药物,可造成雄性大鼠睾丸生殖功能障碍,导致精子发生减少,可做少精子症模型的构建。Yu等采用腺嘌呤灌胃造模,剂量为300mg/kg,造模时间30d。造模组大鼠出现体重下降,血清中T水平、LH、FSH显著低于对照组。造模组精子计数和精子活力下降,精子畸形率升高。精子发生显著抑制及附睾内精子数量减少,提示腺嘌呤可直接损伤生殖细胞造成大鼠精子发生障碍。1.5雌激素有研究表明,雄性啮齿动物摄入炔雌醚会引起睾丸萎缩,导致明显的生精障碍并显著降低生殖细胞和精子的质量。Li等将不同浓度的炔雌醚溶于橄榄油中,对SD大鼠进行两周的灌胃操作。实验组大鼠睾丸的重量随着炔雌醚灌胃浓度的上升而下降,呈剂量依赖模式。在1mg/kg浓度组中,生精小管紊乱、萎缩明显。附睾中精子计数、活力相比对照组显著下降。1.6全氟辛烷磺酸(PFOS)PFOS是一种持久性有机污染物,在工业上应用广泛。近些年来针对PFOS的研究显示,PFOS会通过食物链的富集作用在人体内聚积。有学者发现PFOS具有显著的雄性生殖毒性,目前已在小鼠、猴以及人体中证实PFOS与血清中的性激素异常有关,并有可能进一步导致不育。Qu等将PFOS与玉米油混合后以10mg/kg浓度灌胃C57小鼠,持续时间5周。实验组小鼠5周后睾丸重量和精子计数显著降低,血清中T水平下降。在精原细胞、初级精母细胞中可观察到空泡化,生精紊乱。进一步的研究表明PFOS对生殖系统的损害可能受雌激素受体的介导以及和线粒体通路相关。
2 物理方法
2.1 热效应
精子的正常产生,依赖于睾丸局部温度低于体温。最适合男性睾丸的温度在34~35.5℃之间,一旦睾丸周围温度因某种原因异常升高,就可能出现生精障碍。Kanter等将Wistar大鼠麻醉后,下半身躯干浸没在43℃水中30min,连续操作6d。每次操作后立刻检查阴囊确保没有热效应导致的皮肤损伤。在1d温浴法后,可发现在实验组大鼠中,生精小管内细胞紊乱,生发上皮细胞从管状基底膜分离。14d温浴法后,生精小管的直径大幅度减少,生精小管内仅残存有功能紊乱的Sertoli细胞。35d后组织的退行性改变相比较14d时有所好转,可在生精小管中重新观察到初级精母细胞,提示生精功能有所恢复。
2.2 微波辐射法
男性生殖系统对于微波辐射是高度敏感的,有研究表明微波辐射会使精液参数下降,介导DNA的损伤和细胞的凋亡。Song等将SD大鼠置于树脂玻璃笼内,持续接受900MHz的微波辐射,时间为10d。辐射组大鼠睾丸重量与体重比值显著下降,血清GnRH降低。睾丸组织可见生精紊乱,生精细胞数量减少。附睾中可见大量脱落的细胞,精子缺失。
3 手术方法
3.1 实验性隐睾
研究结果表明,诱发成年雄性大鼠隐睾会显著降低精子活力和抑制素B分泌。Ren等用乙醚麻醉大鼠,通过下切口切开腹腔。然后通过两侧远端睾丸引带的引导,将睾丸移出腹腔,形成隐睾,最后缝合腹股沟管。在诱发隐睾1d后,血浆水平可以监测到LH、FSH、抑制素B以及T水平的显著下降。此外,隐睾导致睾丸间质细胞的功能损伤以及降低精子的产生。隐藏的睾丸在术后3d出现了显著的重量下降,这可能与生殖细胞的大量丧失有关。
3.2 实验性精索静脉曲张
对于精索静脉曲张的病理生理已经有了广泛的研究。有研究模型表明,精索静脉曲张可引起睾丸血流量和温度的增加,同时引起睾丸内睾酮和精子数量的减少。Li等选取KM小鼠,麻醉后经中线开腹,将一个0.8mm直径的金属探针放置到左肾上腺静脉插入内侧,把左肾静脉用3-0丝线部分结扎为其原始外径的50%。绑扎后,小心去除探头,肾静脉可以扩张到缝合环的大小。该手术平均成功率为71%。术后6周通过TUNEL方法评估睾丸内每单位生精小管中的生殖细胞凋亡数量,手术组相对于对照组差异显著。
4 总结
当前,生精障碍动物模型的制备方法可分为三大类别,涉及的物种包括大鼠和小鼠。不同造模方法各有利弊,建议根据不同的研究目的选择不同的动物模型。综合来看,采用化学法制作生精障碍动物模型具有简便、成本低的优点。但是模型的制作过程中化学药品会对动物其他系统的器官造成损害,使造模成功率有所降低。化学药物对动物生殖系统的影响机制尚不明确,值得进一步探索。物理方法造模对于动物生殖系统的损伤较为明确,但是对生精功能的抑制不彻底,应进行更深入的研究以获得较为稳定的造模方法。通过手术法制作生精障碍动物模型,对动物的干预措施最为明确,不影响生殖系统以外的器官。并且不仅可以进行组间比较,也可以与自身进行比较。虽然生精障碍动物模型与临床中男性少精、无精的实际情况有差异,但通过造模可以开展在人体中不符合伦理的实验,通过动物模型探究生精障碍的发病机制对于研究人体的生精异常有很大的帮助。综上所述,目前如研究者无特殊目的大多选择化学方法造模,但现在还没有出现公认的最佳造模方法。在今后的研究中,随着研究的深入以及基因工程技术的成熟,或许将出现更稳定、简便的造模方法。
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