血管紧张素Ⅱ对精子运动参数和胞内钙离子的影响
文章导读:目的:探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)体外对不育症精子运动参数和胞内钙离子的影响。方法:不同浓度的AngⅡ在体外与经上游优化处理的不肓症精子分别共同孵育20、40min,采用计算机辅助精子分析(CASA)检测人精子运动参数;荧光分光光度计检测胞内游离Ca²+荧光强度的变化。结果:AngⅡ(10nmol/L和lOOnmol/L)在体外能显着提高不育症精子活率及运动参数(P<0.05),并激发胞内Ca²+快速升高(P<0.001);Losartan(AngⅡ受体ATl拮抗剂)、EGTA可以明显阻断和抑制这些过程。结论:AngⅡ在体外可以显着增高不育症患者精子的运动参数,其结果可能是通过人精子膜上的ATl受体结合作用后使胞外Ca²+内流而实现的。 |
1.4 主要观察指标
主要观察精子的形态,并对各组精子活力(a+b级)、精子活率、直线速度(VSL)、曲线速度(VCL)、平均路径速度(VAP)侧摆幅度(ALH)、鞭打频率(BCF)等指标分别进行分析。
1.5 精子胞内Ca²+的测定
参照Rossato M方法,将同一患者精子悬液等分成0.5ml/份,分装入5小管。第1管为对照组,第2管为Losartan+100nmol/L AngⅡ组,第3管为孕酮10μg/ml组,第4管为10nmol/L AngⅡ组,第5管为100nmol/L AngⅡ组。在每管各加入Ca²+探针Fura—2/AM达终浓度1μmol/L,37℃恒温水浴箱中避光孵育30min,将负载后的精子悬液500×g离心5min除去上清液,用无钙、镁的BWW液洗涤两次以去除胞外的Fura—2/AM,沉淀用Earle's液制成5×10^6/mL的精子悬液;在第2管中加Losartan达100nmol/L与其余4管避光孵育30min,最后在第2、4、5管分别加AngⅡ达100nmol/L、10nmol/L和1OOnmol/L,第3管中加孕酮达10μg/ml,共同避光孵育30min后用CASA分析,要求其活率≥90%。取0.5mL精子悬液放入配有磁性搅拌子的微量比色杯中,用RF—540荧光分光光度计(日本岛津制作所)检测各组荧光强度。参照郑松等方法,在检测Ca²+动态变化时先测定一段基线后,比色杯中加入AngⅡ使其终浓度为10nmol/L,观察精子胞内Ca²+的改变。反应后加入孕酮,使其终浓度为10μg/ml以作为阳性对照。整个过程仪器连续检测,测得一动态曲线。在另一实验中,精子悬液预加入Losartan达100nmol/L并孵育30min后重复上述实验。
1.6 数据统计分析
各组数据以x—±s表示,应用SPSS11.0统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 精子形态的变化
显微镜下各组精子的形态无变化。
2.2 不同浓度AngⅡ对不育症患者精子活率及运动参数的影响
不同时间段AngⅡ对不育症精子活率及运动参数的作用。经20min孵育后,2、3组与1、4组比较对不育症精子的精子活力(a+b级)、活率、VCL、VAP、ALH、BCF均有显着性差异(P<0.05);3组与4组比较VSL有显着性差异(P<0.05);在40min时2组、3组精子活力(a+b级)、活率、VSL、VCL、VAP、ALH、BCF与1、4组比较均有显着性差异(P<0.05)。两时间段1组与4组、2组与3组之间无差异。
2.2 AngⅡ对不育症患者精子胞内Ca²+的影响
2.2.1 精子内Ca²+荧光值的测定结果表明,AngⅡ1Onmol/L组、1OOnmol/L组、孕酮组明显高于对照组和Losartan组(P<0.01),AngⅡ10nmol/L组、100nmol/L组、孕酮组之间及Losartan组与对照组之间无显着差异性。
2.2.2 加入AngⅡ后精子胞内Ca²+荧光强度呈现一快速上升峰。
2.3 Losartan对AngⅡ引起的Ca²+变化的影响
预加Losartan孵育后,同样加入AngⅡ几乎不引起精子胞内Ca²+的变化,而孕酮仍可引起明显的Ca²+流。
3 讨论
有学者研究,经基因或蛋白检测证实男性生殖系统中包括睾丸、附睾、输精管、前列腺和精子及精液都存在局部RAS。其主要生理效应是通过AngⅡ实现,在局部组织的生理活动调节中发挥重要作用。并已知人输卵管及精子AngⅡ受体的存在,动物实验表明对小鼠精子具有促进获能及促进受精的能力,有效浓度为1nmol/L—100nmol/L。