203例女性外阴尖锐湿疣患者宫颈HPV基因型检测及分析
文章导读:目的:探讨206例女性外阴尖锐湿疣(CA)患者宫颈感染人乳头瘤病毒(HPV)的基因型分布。方法:采用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术,对203例女性外阴尖锐湿疣患者宫颈进行HPV感染分型检测。结论:根据本组病例,对于女性外阴尖锐湿疣患者,应重视宫颈HPV基因分型的检测;高危型及多重型别感染者有必要进一步检查及随访。 |
尖锐湿疣(condyloma acuminate,CA)是由人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染所致,发病率逐年增加,已成为仅次于淋病的第二大性传播疾病。其中女性患者多以外阴及肛周皮肤赘生物形态出现,较直观,易诊断。但因为此病为性传播疾病,传染性强,易复发,很多女性患者在外生殖器感染此病毒的同时宫颈也受累,有的直接表现为菜花样赘生物,有的表现为宫颈炎,甚至有的肉眼看并无异常。而且目前宫颈癌的发病与HPV关系密切,尤其是高危HPV的感染。
人乳头瘤病毒模型
因此我们有必要对此类患者进行HPV的基因分型,以便指导其进行治疗与预防。导流杂交基因芯片技术是近年来检测HPV亚型的一门新技术,可同时一次性检测到21种HPV DNA的基因型,本文拟通过该技术来检测女性外阴CA患者宫颈HPV DNA,探讨其HPV基因型分布特点。
1 材料与方法
1.1 研究对象
203例女性外阴尖锐湿疣患者均来自我院2010年6月至2011年6月皮肤性病科门诊,年龄17~45岁,平均年龄29岁。均为具有典型临床症状、醋酸白试验阳性的病人,且确认无妊娠、非月经期。
1.2 仪器与试剂
DNA提取试剂盒和21种亚型人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒由凯普生化公司提供,PE9600PCR和HybriMax医用核酸分子快速杂交仪由东莞市太平人民医院中心检验科PCR室提供。
1.3 标本采集
所有患者首先用无菌棉拭子将宫颈口过多的分泌物轻拭干净,专用HPV采样刷紧贴宫颈口顺时针旋转5周,取得脱落细胞后,把宫颈刷加入取样管内,以细胞保持液保存,置于4℃冰箱保存待检。患者术前1天无性生活,术前3天无阴道用药等治疗,取样及检测均专人负责。取材同时记录患者宫颈肉眼下形态,分三种:①菜花或鸡冠样赘生物;②红肿,颗粒样等类似慢性宫颈炎外观;③光滑。
1.4 HPV基因分型检测
采用HybriMax技术检测21种HPV亚型(包括HPV6、11、16、18、3l、33、35、39、42、43、44、45、51、52、56、58、59、68、53、66和CP8304)。基本原理是先将病毒基因的DNA进行基因扩增,然后利用核酸分子快速导流杂交技术法,使目的分子导流穿过固定有DNA探针的低密度基因芯片薄膜上,使其发生快速杂交。
实验步骤:①样本HPV DNA提取:采用凯普公司DNA提取试剂盒抽取病毒基因组DNA,按试剂盒要求进行。②PCR扩增:采用PE 9600进行PCR扩增。反应条件为20℃ 10min→95℃ 9 min→95℃ 20 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s扩增40个循环→72℃延伸5 min。每批同时扩增HPVl8阳性对照和阴性对照各一份。③核酸分子快速倒流杂交:扩增产物95℃变性9min→冰浴2 min→加入检测孔内10 min的导流杂交→加入封阻液封闭,酶标显色。④结果判断:肉眼观察,按芯片上HPV亚型分布相应着色点位判断结果,阳性点呈蓝紫色圆点,多个圆点阳性即为多重感染,每张芯片设有PCR反应质控点和杂交显色质控点各一个。
2 结果
2.1 HPV DNA的基因型检测结果
本研究所有病例标本203例中,有123例检出HPV DNA的基因型,检出率为60.59%,其中高危型感染阳性率达到78.04%,低危型69.10%。所有能检测出的21种基因型中,共检测出20种,未发现HPV43型。表1列出基因分型的结果。
2.2 感染类型检测结果
实验中共203例女性外阴尖锐湿疣患者,其中123例宫颈HPV阳性患者中,单一型感染者80例,以HPV11、6型为多见。多重型别感染者43例,其中双重感染20例,三重感染14例,四重感染7例,五重感染2例;以两种、三种同时感染多见。