Hedgehog信号通路在尖锐湿疣皮损患者中的影响研究
文章导读:本组共收集56例尖锐湿疣患者、40例尖锐湿疣治疗患者以及20例正常人,应用ELISA、Western以及RT-PCR法检测尖锐湿疣皮损患者、咪喹莫特治疗一个疗程后观测患者及正常人皮肤中Patched-1、Gli-1以及Smo的蛋白及mRNA的表达特点。结果:三组Patched-1、Gli-1以及Smo三个指标ELISA以及Western蛋白、RT-PCR mRNA表达,患者组均明显高于对照组(P<005),同时治疗组三个蛋白和mRNA表达略高于正常组。 |
尖锐湿疣(condyloma acuminata,CA)是临床中最为常见的性病之一,近年来随着人们交流的日益增加及一些众所周知的原因,其在性病科的发生率逐年增高,已经成为仅次于淋病的性病之一。本病是由人类乳头瘤病毒(Papilloma Virus,HPV)引起,发生后治疗方法较多,但总有部分患者复发。目前,临床中还没有一种单一的治疗方法根除HPV,这可能与HPV进入人体皮肤后发病机理没有完全明确有关。近年来关于Hedgehog信号通路的研究越来越多,但其与CA的关系目前在报道较少,本次作者着眼于此,探讨分析Hedgehog信号通路在CA中的作用,以为研究本病的感染机理提供一定的参考。
1 资料与方法
1.1 病例入选标准
本组收集尖锐湿疣治疗患者均来源于我院皮肤科门诊2013年2月至2014年4月收治的患者,所有患者均诊断为典型CA病患,共96例,男58例,女38例,中位年龄29.6岁,病程4d~4个月,平均(26.4±10.3)d;其中56例为首次确诊为尖锐湿疣患者,取材前未接受相关药物治疗,另40例尖锐湿疣患者为确诊且接受为期1疗程的治疗,分别记为未治疗组(56例)和治疗组(40例)。抽取同期于我院体检健康者20例为对照组(男女各10例,中位年龄28.7岁),行皮肤液的提取均经本人同意,并签署知情同意书。
排除标准:排除同时合并心、肝、肾等严重脏器器质性病变患者,排除合并高血压、高血脂、糖尿病、甲状腺疾病等相关内分泌疾病患者,排除贫血、白细胞异常减少或存在其他自身免疫性疾病患者,排除复发性尖锐湿疹患者。
未治疗组纳入标准:确诊前未接受其他药物治疗;未合并银屑病、淋病、梅毒等其他皮肤性疾病。
治疗组纳入标准:为首次尖锐湿疣确诊患者,且刚完成为期1疗程抗病毒治疗,治疗过程中均依医嘱按时服药;未合并银屑病、淋病、梅毒等其他皮肤性疾病。
1.2 标本采集方法
患者皮肤组织液的采集时间为早上8点到10点,收集皮肤提取液1mL,收集后立即置于零下80℃超低温冰箱保存,待统一做实验时取出用。
1.3 试剂盒与抗体
人GLI家族锌指蛋白1(GLI1)ELISA试剂盒购于上海信裕生物科技有限公司(生产批号:11814273001,规格96T)、Patched/PTCH检测ELISA试剂盒购于德国QIAGEN试剂盒(产品编号:301305,SuperFect Transfection Reagent ,规格1.2ml)、Smoothened蛋白(SMO)检测试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司(货号:EIA-14657 ,规格:96Wells);ECL发光试剂盒(货号:WB043,规格:100mL)、多克隆抗体Patched-1、Gli-1以及Smo以及单克隆抗体β-actin购于Santa Cruz公司,二抗购于武汉博士德生物工程有限公司,总RNA提取试剂盒购自SunShineBio公司(货号:R-4875,规格:50次),引物购于生工生物(上海)股份有限公司。
1.4 相关指标检测方法
Patched-1、Gli-1以及Smo的测定方法为Elisa法,同时Western Blot以及RT-PCR进一步确认。
1. 5Western Blot检测
取0.5mL表皮提取液,5000r/min离心提取上清液,BCA定量蛋白,取各样本80μg行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,取电泳后目标蛋白半干转法移至PVDF膜,加牛奶封闭2h后取出,加相应一抗洗涤3次,之后加相应二抗洗涤3次,暗室内曝光洗片,扫描仪扫描胶片图像、Image J计算各灰度值,β-actin作内参对照。
1.6 RT-PCR检测
取样本总RNA提取试剂盒提取总RNA,定量,定量后每取2μg逆转录cDNA;逆转出cDNA立即行PCR扩增目的片段,扩增次数为35次;扩增出DNA片段后电泳,电泳完成后用凝胶成像仪拍照,Image J软件计算荧光强度值,β-actin作内参对照。
β-actin引物设计为:Primer A:5′GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3′,Primer B:5′ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3′,产物长度为123bps。
Patched-1引物设计为:Primer A:5′GATGCGTCTGGTTGCGAAGA3′,Primer B :5′CATCTGACTACGTGGAGTGG3′,产物长度为332bps。
Gli-1引物设计为:Primer A:5′CTGTACGAGAGCCTCATGTA3′,Primer B :5′ACGTGTCAGGGTGTTCGAGA3′,产物长度为452bps。
Smo引物设计为:Primer A:5′CCCTGTCGAGAGTACATGTA3′,Primer B :5′GACTGGTGCTATGGTCGAGA3′,产物长度为452bps。
1.7 统计学处理
所有数据处理均用SPSS19.0统计学软件软件,计量资料以均值±标准差(x±s) 表示,各组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 治疗后Elisa
Patched-1、Gli-1以及Smo治疗组三个蛋白Elisa检测结果其表达均明显高于对照组(P<0.05);治疗组Patched-1、Gli-1以及Smo也均高于对照组(P<0.05)。
2.2 Western Blot结果比较
,Patched-1、Gli-1以及Smo患者组三个蛋白表达均明显高于对照组(P<0.05);治疗组Patched-1、Gli-1高于对照组(P<0.05),Smo与对照组基本相近,二者相比没有差异性。
2.3 PCR结果比较
RT-PCR 与Western blot的变化趋势基本相似,Patched-1、Gli-1以及Smo患者组三个mRNA表达均明显高于对照组(P<0.05);治疗组Gli-1高于对照组(P<0.05),Patched-1及Gli-1。
3 讨论
CA具有极强的传染性,一旦发生会给患者带来严重的身心压力,本病传染方式有性行为传播和接触感染患者生活物品两种,其中性行为传播为绝大多数感染方式。在20世纪60、70年代,CA在我国几乎很少见到,但是随着改革开放的进行,特别是20世纪90年代以来,CA开始逐渐流行起来,这些患者绝大多数均有性乱史,且不少患者往往合并梅毒等其它性传播疾病。毫不夸张的说,是性乱加速了本病的传播,本病可发生于任何一个年龄段,其中临床中以20~40岁青中年患者多见。本病在临床中病理形态主要有以下几个特点:(1)患者生殖器官及周围上皮中表层有一些凹空细胞;(2)患者相关组织细胞上有过量的角化或角化不全;(3)患者相关器官部位有一些棘细胞及一些基底细胞增生;(4)患者表皮出现一些尖头状、扁平状、乳头状、内生型以及非典型小块并有向周围扩展的特点。
有研究认为,本病病毒侵入人体并不立即发病,而是有一定的潜伏期,在潜伏期内,HPV侵入表皮细胞,借助于体内的DNA复制系统,完成自我复制同时侵染临近细胞,最终病毒的量达到一定的程度时,则会造成本病发病。但近几年的研究也表明,HPV除了具有自我复制的能力外,也可以抑制抗复制基因的表达,Hedgehog基因是近年来研究较多的一种抑癌基因,但是关于其与CA的研究目前国内外研究较少,Hedgehog基因主要编码Hh蛋白,编码后的Hh蛋白发挥作用需要两种受体基因Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)的激活。受体Ptc由肿瘤抑制基因Patched编码,其蛋白由12个跨细胞膜的肽链构成,能与Hh蛋白直接结合,对Hh蛋白起负调控作用。Smo蛋白是Hh蛋白直接传递所需要的一种受体,其也是一种跨细胞膜蛋白,由7个跨膜区组成,在病毒没有感染的情况下,Ptc抑制Smo蛋白活性,进而抑制了下游的蛋白表达。Gli蛋白受Ptc与Smo蛋白的共同作用,上述两个蛋白抑制下游蛋白的活性是通过Gli蛋白直接作用的,三个蛋白共同构成了Hedgehog信号通路的一环。本文研究结果显示:Patched-1、Gli-1以及Smo三个指标Elisa以及Western蛋白、RT-PCR mRNA表达,患者组均明显高于对照组(P<0.05),同时三个蛋白和mRNA表达治疗组略高于对照组,其还达不到对照组的水平,这可能与药效时间短有关,也可能是其并不能完全杀死病毒,仅抑制了其活性的原因。
综合提示尖锐湿疣皮损表皮中Patched-l、Gli-1以及Smo均处于高表达状态,治疗后可明显降低其活性,今后上述三个指标或许可用为检测药物治疗后评价指标。
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