解脲支原体感染动物模型的研究进展
文章导读:解脲支原体泌尿生殖道感染是常见的性传播疾病,容易导致不孕、流产、新生儿疾病等不良结局。其发病机制尚不清楚,其治疗所产生的耐药现象也是非常棘手的问题,建立解脲支原体感染的动物模型为研究其发病机制、药物作用机制奠定了基础,现将解脲支原体感染的动物模型进行简要综述。 |
解脲支原体泌尿生殖道感染在发达国家及发展中国家都是常见的性传播疾病,容易导致流产、不孕、妊娠感染、胎儿宫内发育迟缓及新生儿疾病等不良妊娠。此病严重影响患者的心身健康及家庭的和睦幸福,所引起的社会问题不容忽视。研究解脲支原体泌尿生殖道感染的发病机制、药物作用机制等,就需要建立解脲支原体感染的动物模型,本文从选择实验动物、菌液接种部位、模型种类三方面进行论述建立解脲支原体感染动物模型。
1 实验动物
解脲支原体泌尿生殖道感染常用的实验动物,有猿猴、狒狒等灵长类动物,及新西兰白兔、大鼠、小鼠等小型哺乳动物。选择不同的实验动物所建立的模型各有其优缺点。灵长类动物成本高,饲养费用高,国内尚未推广,国外利用灵长类动物作为研究对象较多。新西兰白兔体积略小,价格略便宜,所需要接种的解脲支原体菌量略大,所需购买及培养解脲支原体耗费资金相对多,耗时长,作为研究的实验动物应用范围小。大鼠、小鼠作为实验动物,具有体型较小、便于饲养、繁殖周期短、品种丰富等优点,研究中最被广泛应用。
其中灵长类动物(如狒狒、猿猴等)组织结构、生理功能、病理特点与人类更相似,选用这类实验动物所得的研究结果跟人类更接近,对临床更具有指导意义。新西兰白兔输卵管与人类输卵管形态相似,比大鼠、小鼠输卵管长,利于观察输卵管炎症的形态变化;其子宫、输卵管较长,两者分界欠清;阴道与尿道相通,从阴道接种病菌,则有可能造成泌尿系上行感染,不利于观察实验结果。大鼠成熟期早、全年多发情、体型较小鼠大,在研究生殖系统方面多应用,如观察睾丸形态学变化,应用大鼠建立的模型多为有创开腹型。小鼠体积偏小,有利于观察宫颈、阴道的炎症及病理变化,但输卵管短、腔窄,不利于观察输卵管炎症及病理变化。1989年Taylor Robinson等提出BALB/c小鼠对解脲支原体的定植最为敏感, BALB/c小鼠做为近交系小鼠,有免疫缺陷,易于感染,造模无需开腹,造模过程是模拟解脲支原体上行感染途径,为研究解脲支原体泌尿生殖道感染提供有力的实验依据。
2 菌液接种部位
通过不同部位的菌液接种,引起解脲支原体感染的部位不同。菌液接种部位主要分为宫腔内接种、输卵管局部接种、膀胱内接种、阴道内接种、鼻腔或气管内接种五种。
2.1 宫腔内接种
此法将配置好的菌液直接注射入宫腔内或羊膜腔内,以建立子宫内膜及妊娠期宫内感染的模型,对解脲支原体引起不良妊娠结局进行观察探索。Yoder等将解脲支原体血清1型悬液注入到怀孕狒狒的羊膜腔中,此法成功建立了新生儿宫内感染解脲支原体的模型。
2.2 输卵管局部接种
此法将实验动物进行麻醉开腹,将配置好的菌液直接注射入输卵管及输卵管周围,以建立输卵管炎性模型,为进一步研究解脲支原体对输卵管黏膜的致病性。此接种法造模效果好,输卵管有明显的炎性反应,有利于对输卵管炎症进行观察,但与输卵管炎上行性感染的途径不同,有可能改变机体和输卵管的局部防御机制,或直接损伤输卵管,局部易出现积液、积脓、阻塞等后遗症。
张帝开等将新西兰白兔麻醉成功后,常规剪除腹毛,无菌操作下切开腹壁进入腹腔,用标准株、临床分离株的菌液分别注入新西兰白兔输卵管伞部,通过病理切片观察输卵管黏膜上皮损伤,表现为输卵管管腔渗出物较多,黏膜层出现上皮细胞轻度肿胀,黏膜下层出现以淋巴细胞为主的灶性浸润,成功建立了输卵管炎性模型。
2.3 膀胱内接种
此法将实验动物进行麻醉开腹,充分暴露膀胱, 先用注射器将膀胱内残余尿液抽尽,将配置好的菌液直接注射入膀胱内,然后逐层关腹缝合,以建立解脲支原体性尿道炎的模型,为研究尿道炎、解脲支原体感染导致不育等提供了有力的形态学依据。此接种方法造模效果好,但与尿道炎上行性感染的途径不同。
杨建宏等给雌雄各半的大鼠膀胱内注射菌液,形态学表现为:(1)尿道黏膜上皮细胞出现空泡变;(2)基底层、固有层内有炎细胞浸润、局灶性增生、间质水肿;(3)黏膜组织出现细胞核形不规则、畸变,核膜下出现染色质浓缩,胞质内出现大量次级溶酶体颗粒、有大量线粒体出现嵴性肿胀或空泡变性。胡海翔等、毛武塬用此法接种雄性大鼠膀胱内,造成雄性大鼠睾丸炎症,形态学表现为:睾丸重量减轻、体积萎缩、曲细精管变性、间质渗出水肿、生精细胞减少,提示解脲支原体感染引起睾丸组织病理损伤、影响睾丸功能、干扰精子生成。
2.4 阴道内接种
此法实验动物在无麻醉的状态下,将配置好的菌液直接进行阴道内接种,形成病原菌上行感染,以建立解脲支原体感染尿道、宫颈、输卵管的模型。此接种方法与人类自然的病原菌上行感染的途径类似,研究所得结果更能揭示疾病本身的发病规律。目前该法所采用接种的菌种、浓度、是否激素预处理,是建立动物模型成功与否的关键。采用该法的实验动物多为大鼠、小鼠及新西兰白兔。
1989年Taylor Robinson用小鼠在接种菌液前进行雌激素预处理,在第二次注射雌激素后,将菌液注入小鼠阴道,此为目前报道的经雌激素预处理,首次成功建立了解脲支原体感染动物模型。解脲支原体能够定植于小鼠生殖道,其阴道黏膜出现多核白细胞减少或消失,能够上行播散至卵巢、脾、肝。张连娣等采用同法造模,发现小鼠最适宜感染血清8型菌液的浓度为2.5×105CCU/mL,小鼠感染解脲支原体后阴道口红肿、分泌物增多,随着感染时间延长,部分小鼠会脱毛及局部溃烂,造模结束后选取小鼠宫颈、子宫角、阴道等组织进行解脲支原体培养均为阳性,其病理学表现为急慢性炎症改变,感染解脲支原体途径可模拟上行感染。苑贺英采用BALB/c小鼠,采用同法造模,接种血清8型菌液(浓度为1.0×104CCU/mL,50μL/只),接种后倒置小鼠,与小鼠充分接触;实验结束后,确认造模成功,其感染以慢性炎症为主。孙源梅等采用同法造模,接种血清4型菌液,比较SD大鼠、BALB/c小鼠的造模成功率,结果:接种血清4型,BALB/c小鼠造模成功率达100%,SD大鼠为0%,P<0.05,有显著差异,BALB/c小鼠比SD大鼠造模更容易成功。
建立新西兰白兔模型与大鼠、小鼠模型同样需要雌激素预处理,不同之处在于新西兰白兔首先需要建立脱污染,每只白兔局部消毒后,阴道内注入混合抗菌液,待取白兔阴道内、宫颈管分泌物涂片无细菌检出,培养无细菌生长,提示脱污染模型成功建立;第二,皮下注射雌激素;第三,接种菌液,根据纪榕荣的研究血清1型随接种浓度增高,宫颈管的阳性检出率、定量值及致病率增高;第四,确认新西兰白兔生殖道解脲支原体感染模型建立:通过培养法、FQ-PCR等法检测解脲支原体,组织病理示感染后以密集浆细胞及淋巴细胞浸润为主的慢性炎症。
根据刘淑荣的研究,阴道内接种相同浓度的解脲支原体血清3型、血清8型、两种混合型菌液均可使雌性新西兰白兔致病,其致病性、定植率以混合型最强,其次是血清8型,第三是血清3型;在白兔生殖道中,不同生物群的致病浓度可能存在差异,血清8型的致病浓度可能为≥104copy/g。
2.5 鼻腔或气管内接种
此法实验动物多在深度麻醉的状态下,将配置好的菌液于鼻腔内注射或气管内注入,以建立解脲支原体肺部感染的模型,为研究新生儿解脲支原体肺部感染奠定了基础。
1989年Rudd等采用直接向C3H/HeN和C57Bl/6N新生小鼠鼻腔内注射血清型1和血清型10的菌液,为今后建立新生儿肺部解脲支原体感染动物模型奠定了基础。2002年Viscardi等深度麻醉小鼠后于气管内注入解脲支原体血清3型和临床分离菌株,成功建立了C3H/HeN小鼠解脲支原体肺部感染动物模型。2003年Benstein BD等通过鼻内接种菌液,采用原位杂交技术检测感染小鼠,发现解脲支原体定植于肺内细支气管、肺泡上皮细胞和巨噬细胞;其中在巨噬细胞的定植,是解脲支原体引起肺部疾病的证据。
3 模型种类
目前,国内、外已成功建立多种解脲支原体感染动物模型,主要包括呼吸道感染模型和泌尿生殖系统感染模型,在建立解脲支原体呼吸道感染模型过程中不需雌二醇预处理,多名研究者采用C3H/HeN小鼠成功建立了该模型;在建立解脲支原体泌尿生殖系统感染模型过程中,雌二醇的预处理必不可缺,实验动物首选BALB/c小鼠。
3.1 呼吸道感染模型
解脲支原体在新生儿肺部的定植可以引起肺炎、支气管发育不良、支气管病变,通常选择C3H/HeN小鼠,在麻醉状态下,将配置好的解脲支原体菌液注入鼻腔或气管内。
3.2 泌尿生殖道感染模型
3.2.1 宫内感染动物模型 在妊娠妇女和新生儿中,解脲支原体感染可分别引起绒毛膜羊膜炎、新生儿肺部疾病。Yoder等将解脲支原体血清1型107CFU/mL悬液5mL注入怀孕狒狒的羊膜腔中,成功建立了解脲支原体肺炎宫内感染模型。周丽萍等建立了昆明小鼠解脲支原体宫内感染模型,同样参照Taylor Robinson、Furr等的研究方法,在昆明小鼠配种后12.5d,在其阴道内分别血清4、1、9型解脲支原体悬液(2×104CFU/mL)注射100μL,建立了孕鼠、子鼠解脲支原体感染模型。
3.2.2 泌尿生殖道感染动物模型 上世纪70年代以前,国外学者曾用解脲支原体接种多种哺乳动物未定植成功,曾认为从人体分离出来的解脲支原体只能在人体内生存繁殖。直到1989年Taylor Robinson等用雌激素预处理的方法,成功建立小鼠生殖道解脲支原体感染的模型,而没有经过雌激素预处理的小鼠,解脲支原体尚不能在生殖道完成定植。目前这种造模方法仍在解脲支原体研究中被广泛应用、借鉴。此后国内一些学者,提出用昆明种小鼠建立生殖道解脲支原体感染的模型,价格低廉。Shkarupeta等参照Taylor Robinson的造模方法,选用BALB/c小鼠上建立了人型支原体感染的动物模型。在Tuffrey研究中,发现实验前用孕激素预处理,孕激素可抑制小鼠的发情周期而提供更多的靶细胞被感染,能使解脲支原体感染更为迅速、更为有效。在李文瑾等研究中发现,解脲支原体菌液接种量及接种次数的增加可增加小鼠解脲支原体的感染率。杨建宏等建立Wistar大鼠解脲支原体性尿道炎模型,应用解脲栓干预治疗,采用酶免法及放免法检测血清TNF-α、IL-6、IgA,研究结果显示,解脲栓能降低解脲支原体感染大鼠血清TNF-α、IL-6的高水平,提高IgA含量,解脲栓有降低炎症因子水平、保护尿道黏膜抗感染的作用,起到调节大鼠细胞免疫、体液免疫功能。韩延华等建立BALB/c小鼠生殖道感染血清8型解脲支原体模型,以中药复方消抗灵Ⅱ号作为治疗组与阿奇霉素对照,结果显示治疗组转阴率高达95%,明显高于对照组(60%),两者差异有统计学意义;消抗灵Ⅱ号能有效地降低支原体感染小鼠血清TNF-α和血清IFN-γ高水平,与阳性对照组、模型组比较,有极显著差异。
建立适宜的动物模型是研究解脲支原体呼吸道及泌尿生殖道感染的重要手段和途径,选择合适的动物模型作为研究对象,为进一步研究解脲支原体感染的发病机制、宿主的免疫反应、解脲支原体感染的防治、中医药抗解脲支原体感染的作用机制提供了研究平台。
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