左归丸对少弱精子症大鼠模型生殖内分泌激素的作用研究
文章导读:将36只雄性SD大鼠随机平均分为正常组、模型组及左归丸组,每组12只,共计8周。模型组前4周用去离子水进行干预,5~8周用40mg/(kg•d)的雷公藤多苷进行造模;左归丸治疗组前4周用6g/(kg•d)的左归丸混悬液进行预防性干预,5~8周用40mg/(kg•d)的雷公藤多苷进行干预。检测大鼠精子参数;测量睾丸的重量,计算睾丸脏器系数;测定血清黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌激素(E2)、泌乳素(PRL)、睾酮(T)、抑制素B(INHB)及附睾肉毒碱(EC)含量。结果:左归丸组与模型组相比,大鼠睾丸脏器系数、精子质量(活力、数量)、血清FSH、LH、T、INHB、EC含量方面的差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);但INHB、EC水平仍与正常组有一定差异(P<0.05)。 |
男性不育症,一直以来就是生殖领域研究的热点。以往研究表明,由男性因素导致的不育症约占40%,其中,65%~70%左右的男性不育症病因及发病机制尚十分不清楚,大多数只表现为以少精子症和/或弱精子症为主的精子质量异常。雷公藤多苷(GTW)是临床上常用的抗炎药物和免疫抑制剂,但长期服用会导致男性患者精子数量减少、活动力下降,严重者甚至造成不育。我们前期对GTW诱导的少弱精子症大鼠模型的造模时间和剂量进行了细致探索,得到了较为理想的模型。目前,单纯的西药治疗少精子症及弱精子症效果并不理想,而一些补肾类中药方剂的使用可以明显提高疗效,如明代张景岳所制名方“左归丸”。本研究主要观察“左归丸”对实验性少弱精子症大鼠精子质量、睾丸/附睾脏器系数、生殖激素水平、附睾肉毒碱的影响,探讨左归丸对少弱精子症的预防作用。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物:SPF级雄性SD大鼠,鼠龄均为12周,平均体质量为(280±30)g,共36只。全部SD大鼠均由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司统一提供。药品和试剂:本研究中所使用的雷公藤多苷片全部由安徽新陇海药业有限公司生产制造,规格为10mg/片,批号130801;左归丸由河南宛西制药厂统一制造,规格为12袋/盒,9g/袋,批号131209。仪器:普通光学显微镜(Olympus L340099);恒温水浴箱;伟力精子测试仪(中国 WLJU-9000);轮转式组织切片机;精密电子天平(Mettler AE160);pH Mrter(日本 TOA HM-20E);不锈钢细胞筛;细胞计数板;剪刀;电热恒温培养箱20~60℃;电子称;低温高速离心机(Germany MIKR002R);r-911全自动放免计数仪等。
1.2 方法
动物分组:实验动物适应性喂养7d后,未见明显异常即可按照实验方案进行实验。将36只雄性SD大鼠进行编号,使用普通电子秤对其体质量进行称重并记录,采用随机数字表法,将其随机分为正常组、雷公藤多苷模型组、左归丸组,每组12只。造模及给药方法:正常组全部采用去离子水进行干预,共8周;模型组前4周用去离子水进行干预,5~8周用40mg/(kg•d)的雷公藤多苷进行造模;左归丸组前4周用6g/(kg•d)的左归丸混悬液进行预防性干预,5~8周用40mg/(kg•d)的雷公藤多苷进行干预。8周后处死大鼠,抽取腹主动脉血,离心后取上清液,摘取睾丸及附属性腺组织,称重后进行相关指标检测。
1.3 观察指标
一般情况:观察实验过程中各组大鼠的精神状况、活动情况、体毛光泽度、饮食水量、体质量、排尿、排便等具体情况的变化。体质量及睾丸、附睾脏器系数:采用普通电子秤对实验大鼠称重后进行麻醉。麻醉后迅速处死大鼠,开腹取出双侧睾丸、附睾组织,用冷生理盐水冲洗,除去血液,滤纸擦干,采用精密天平对各组织进行称量并记录,结果取双侧平均值。采用睾丸、附睾质量与体质量的比值计算各自脏器系数,脏器系数=脏器质量/体质量×1000‰。精子活动力以及精子计数:将实验大鼠双侧附睾称重后,取右侧附睾置于2mL生理盐水,将组织剪碎,然后在37℃水浴箱中孵育5min,取一滴精子混合液滴在玻片上,采用普通光学显微镜对精子活动力进行观察;同时采用不锈钢细胞筛对精子混合液进行过滤,将滤液置于离心机中(4000r/min,5min),取出沉淀物,加入1mL精子固定液充分混匀,使用细胞计数板对精子混合液进行精子计数。具体观察计数方法,按照WHO标准进行。血清性激素、抑制素B及肉毒碱水平:采用放射免疫试剂盒对所有大鼠的血清FSH、PRL、E2、T、LH、抑制素B含量进行检测;采用比色法对附睾肉毒碱水平进行检测。
1.4 统计学方法
本研究对所有实验数据采用SPSS21.0统计软件进行分析处理。计量资料以均值±标准差(x±s)来表示,经正态性检验及方差齐性检验后,若符合正态分布,多组间比较采用单因素方差分析;若不符合正态分布,则采用非参数检验。其中,P<0.05具有统计学意义,P<0.01则具有显著的统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
正常组大鼠精神状况良好,活动敏捷,体质量逐渐增加,体毛浓密且有光泽,饮食水正常,大小便正常;模型组大鼠前四周与正常组无明显差异,但腹腔注射GTW第3~4d起,逐渐出现精神萎靡,活跃度下降,饮食水明显减少,体质量下降,抱团,体毛略有稀疏、缺少光泽;左归丸组大鼠前4周以左归丸灌胃后体质量增加较快,精神较好,活跃度较高,其他与正常组无明显差异,GTW灌胃后,开始较正常组精神、体重、反应、皮毛光泽度均有所下降,但整体状态较模型组更好。实验中,正常组死亡1只SD大鼠,经解剖鉴定,判断为灌胃针损伤气管致死,与实验药物无相关性。
2.2 体质量与睾丸、附睾脏器系数
本实验第8周将所有大鼠处死后,取其双侧睾丸、附睾,并采用精密电子天平进行称重、记录,分别计算与体质量的比值,得出各组织的脏器系数。结果:雷公藤多苷诱导的少弱精子症模型组睾丸、附睾脏器系数最低,左归丸组较正常组基本处于同一水平,明显高于模型组。
2.3 精子质量
本实验主要对大鼠精液中的精子总活动力、a级精子百分率、精子计数进行检测,并对各组之间上述指标进行统计分析。结果:模型组在精子总活力、a级精子百分率、精子计数方面明显低于正常组,而采用左归丸先进行预防性干预后,精子质量各参数均有下降趋势,但较正常对照组水平差异不明显。2.4生殖激素水平对各组大鼠血清生殖内分泌激素(FSH、LH、E2、PRL、T、抑制素B)及附睾肉毒碱(EC)进行检测。结果:与正常组相比,模型组大鼠血清T、INHB、EC水平明显下降,FSH水平均明显升高,LH有升高趋势,但无统计学意义;与模型组相比,左归丸组LH、FSH水平降低,具有统计学意义,T、INHB水平明显升高,与正常组水平趋近,EC含量升高,有统计学意义,但较正常组仍有差异。各组之间PRL、E2未见明显差异性。
3 讨论
3.1 少弱精子症大鼠模型
我们前期对少弱精子症造模药物雷公藤多苷的使用剂量及时间进行了深入研究,结果证实应用40mg/(kg•d)的雷公藤多苷进行造模4周形成的少弱精子症大鼠模型较为合理,模型大鼠在生殖器官脏器系数、附睾精子活力数量、生殖激素水平及睾丸组织学方面的改变与文献中报道的少弱精子型生精障碍大鼠模型的表现基本一致,证明模型是成功的。本实验在模型研究的基础上进一步探索左归丸对少弱精子症大鼠模型脏器系数、精子参数及生殖内分泌激素方面的影响。
3.2 生殖内分泌激素及附睾肉毒碱与精子质量的相关性
精子的发生和成熟主要受到下丘脑-垂体-睾丸轴的调控。下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)刺激腺垂体释放LH、FSH,其中LH作用于睾丸间质细胞,刺激产生T,并与T一起促进精子发生成熟、雄性生殖器官的发育分化及维持正常的性功能;FSH本身能与精曲小管的支持细胞膜受体结合,使精曲小管腔内的T浓度维持在较高的水平,促进生殖细胞分化为成熟的精子,同时刺激支持细胞分泌INHB,INHB则参与垂体功能的调节,并在睾丸生精过程通过旁分泌的方式调节支持细胞的功能。此外,INHB水平和精子密度有显著正相关关系(r=0.46,P<0.001),因此INHB可能对男性睾丸生精功能起到更直接的预测作用。男性生殖器官本身不能产生肉毒碱,其来源主要通过附睾对血浆中肉毒碱的主动摄取而高浓度的集中于附睾当中。而肉毒碱在精子线粒体的脂肪酸β氧化和三羧酸循环过程中起着重要作用。一方面,它能携带脂肪酸通过线粒体膜,反应产生的乙酰辅酶A直接参与ATP的形成,进而为精子的运动提供重要能源;另一方面,肉毒碱还能间接通过刺激支持细胞对葡萄糖的吸收来影响精子的成熟和代谢过程。因此,附睾肉毒碱的水平不仅直接反映出附睾的功能状态,而且还反映着精子的成熟度。
3.3 左归丸对少弱精子症大鼠模型的预防作用
中医认为肾藏精,主生殖,为先天之本。肾精充盈,则能化气成形;肾精亏虚,则肾阴肾阳无化生之源。因此,肾精的盛衰决定着男子的生育能力,肾精亏虚是男性不育症的主要原因。由此,我们认为“肾精亏虚”是少弱精症形成的基本病机,治疗上应以“滋肾阴,填肾精”为主。左归丸乃明代医家张景岳所创,是“益阴填精”的代表方剂,具有补肾滋阴、填精益髓的功效。方由熟地、龟板胶、鹿角胶、山萸肉、山药、枸杞子、菟丝子、川牛膝组成。我们前期对800例男性不育症患者的中医证型进行了调查,结果显示649 例(81.1%)患者属于肾精亏虚、肾阴不足的基本证型 ,并运用左归丸改善少弱精子症患者精液量、精子密度、精子成活率、活动率、液化程度等方面显示了很好的临床作用。本研究发现:左归丸组大鼠与模型组相比,睾丸及附睾的脏器系数、附睾精子活动率和计数均有明显改善;T、INHB水平明显升高(P<0.01),并于正常组水平接近;FSH、LH水平有所下降(P<0.05);EC水平提高(P<0.05)。说明GTW对大鼠睾丸生精功能及附睾成熟活化功能有明显的损害作用,从而妨碍精子的发生、成熟,左归丸则能够对GTW的影响产生拮抗作用,这与国内一些学者研究补肾类中药能够拮抗雷公藤多苷诱发的生殖损伤作用相一致。本研究的特色在于探讨了左归丸对GTW损伤大鼠生殖功能的预防作用,将左归丸提前4周应用于大鼠,然后进行GTW损害实验,结果证实左归丸组大鼠睾丸及附睾脏器系数、精子活率和数量、生殖激素水平、附睾肉毒碱含量虽较正常组有一定差异,但与模型组相比改善明显。说明早期应用左归丸能减轻GTW对大鼠生殖器官、精子质量、生殖激素的影响,即左归丸对少弱精子症大鼠模型具有一定的预防作用。本研究为“左归丸”在临床上预防性治疗男性少弱精子症提供了实验依据,体现了中医“治未病”的思想。但左归丸重在滋阴填精,对阳气亏虚及湿热偏盛之人若单纯久服疗效欠佳,甚至可能反增其害,临床上还应辨证论治,随症加减。另外,本研究应用雷公藤多苷作为造模药物有一定的自愈倾向,尚不够客观,有待进一步研究
来自《中国性科学》杂志 转载请注明出处