HPV感染基因型在宫颈正常组织、宫颈鳞状细胞癌和腺癌组织中的分布情况分析
文章导读:选取56例宫颈正常组织、48例宫颈鳞状细胞癌组织、45例宫颈腺癌组织分别记为对照组、鳞癌组和腺癌组,均采用PCR以及基因芯片技术对HPV感染23种基因进行分型检测,观察不同组别中其分布情况,并对各组相关资料进行回顾性分析。结果:鳞癌组HPV感染阳性率(91.67%)和腺癌组(73.33%)均远远高于对照组(10.71%)(P<0.05),且腺癌组HPV感染阳性率也显著低于鳞癌组(P<0.05);对照组、鳞癌组和腺癌组一重感染、二重感染和多重感染分布情况均存在显著差异(P<0.05);对照组6例HPV感染阳性患者中,HPV-43基因型所占比例最高,为62.50%;鳞癌组44例HPV感染阳性患者中,HPV-16和HPV-18基因型所占比例最高,分别为40.57%和19.81%;腺癌组33例HPV感染阳性患者中,HPV-16和HPV-18基因型所占比例最高,分别为29.58%和19.72%。 |
宫颈癌发病率逐渐呈现升高和年轻化发展趋势,并且在发展中国家表现更为明显。据统计,我国每年新发宫颈癌超过13万,死亡约3万,严重威胁妇女身心健康和日常生活质量。随着对HPV感染和宫颈癌临床关系研究逐渐深入,长期持续性HPV感染已成为公认的宫颈癌前兆,可知HPV感染防控、宫颈上皮内瘤变及时治疗均是宫颈癌临床防治工作的重中之重。但是目前状况下,宫颈癌预防和治疗效果并不理想,推测其中原因为HPV感染对宫颈癌发生和发展作用机制尚未完全明确,因此缺乏特效、靶向治疗目标,影响预后疗效。基于此,本研究特选取正常宫颈组织、宫颈鳞状细胞癌和腺癌组织采用生物检测技术确定HPV感染和基因型分布情况,在为进一步深入研究奠定理论基础的同时,期待为宫颈癌防治研究提供实践依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2013年1月至2016年3月存档的宫颈正常组织56例、宫颈鳞状细胞癌组织48例、宫颈腺癌组织45例作为研究对象,并分别记为对照组、鳞癌组和腺癌组。其中对照组为宫颈癌手术切除患者癌旁正常组织,患者年龄29~62岁,平均(45.71±5.60)岁;鳞癌组患者年龄32~64岁,平均(46.78±5.57)岁;腺癌组年龄30~61岁,平均(45.82±5.62)岁,三组平均年龄无显著差异(P>0.05)。纳入标准:(1)所有选取组织均经医院病理处检验复查,分别确诊为宫颈正常组织、鳞癌组织和腺癌组织;(2)所有受试对象均符合我院临床基础研究伦理条件和要求。排除标准:(1)合并其它类型原发性恶性肿瘤,宫颈转移者;(2)合并其它类型宫颈疾病者,如慢性宫颈炎症、宫颈癌前病变者;(3)临床资料不完整或组织保存质量较差者。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器 (1)试剂:枸缘酸盐缓冲液(PBS);0.1%浓度的多聚赖氨酸溶液(粘片剂);HPV试剂盒;A液(100mL 20×SSC,10mL浓度为10%的SDS,添加自来水定容至1000mL);B液(25mL 20×SSC,10mL浓度为10%的SDS,添加自来水定容至1000mL);C液(100mL 0.1M的柠檬酸钠,添加自来水定容至1000mL)。(2)仪器:切片机(德国Leica RM2135型);移液器(美国Thermo Finnpipette型);显微镜(日本Nikon 80i型);微波炉(中国Galanz P7021TP-6型);恒温箱(中国福马 GHX-9270B-1型);恒温冰箱(中国荣事达BCD-245F型);搅拌器(中国国华 88-1型);台式离心机(德国HERML Eppendorf 5418型);膜条(中国上海酶联生物)。
1.2.2 HPV感染基因型检测方法 (1)提取HPV DNA:三组患者中每例组织均常规制作4张石蜡切片,加入裂解液后尽量将切片彻底捣碎,混合均匀后在100℃条件下水浴,待10min后无需冷却立即行离心分离处理,转速为13000r/min,处理时间为5min,扩增模板需采用中层DNA溶液;将PCR反应管取出后再次离心分离,转速为5000r/min,处理时间为2min;取出待测DNA样本。(2)PCR扩增反应条件:95℃预变性(10min)、94℃变性(30s)、42℃复性(30s)、72℃退火(30s,共进行40个循环)、72℃延伸(5min)、42℃退火(10min),4℃保存。(3)杂交和洗膜:水浴锅100℃、杂交箱51℃,夹取一张事先标好编号的样本膜条,首先加入6~8mL A液、PCR反应产物,沸水浴10min,此过程需要注意杂交液液面低于沸水浴液面,转移至杂交箱中,2.5~3h后加入50mL B液,置于水浴箱中,待温度达到51℃时采用相同方法将PCR产物和膜条杂交;将膜条取出后迅速转移至事先预热至51℃的B液中,将反应体系转移至杂交箱中,轻摇洗涤,时间为5min。(4)显色:将A液和辣根过氧化物酶按照2000∶1比例配置孵育液,室温下孵育30min,然后依次用A液和C液洗膜,浸于显色液中避光保存,于30min后观察显色结果。(5)膜条扫描和结果判定:采用PCR反应系统对应阅读仪扫描膜条,并保存结果;每张膜条出现蓝色斑点位置即可确定HPV基因型。
1.3 观察指标
(1)观察不同组别HPV感染情况,包括一重感染(即一种HPV感染基因型)、二重感染(即两种HPV感染基因型)和多重感染(即三种或更多HPV感染基因型),并比较HPV感染阳性率;(2)观察三组HPV感染基因型分布情况。
1.4 统计学分析
各组组织HPV感染基因型分布情况采用HPV分型统计软件完成;所得数据采用SPSS17.0处理分析,HPV感染阳性率以及基因型分布情况均采用率(%)描述,比较采用One-way ANOVA检验,若P<0.05,则认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HPV感染情况
对照组HPV感染阳性率为10.71%,较鳞癌组和腺癌组的91.67%和73.33%显著降低(P<0.05),且腺癌组HPV感染阳性率也显著低于鳞癌组(P<0.05);三组一重感染、二重感染和多重感染分布情况差异也均有统计学意义(P<0.05)。
2.2 HPV感染基因型分布情况
对照组6例HPV感染阳性患者中,HPV-43基因型所占比例最高,为62.50%;鳞癌组44例HPV感染阳性患者中,HPV-16和HPV-18基因型所占比例最高,分别为40.57%和19.81%;腺癌组33例HPV感染阳性患者中,HPV-16和HPV-18基因型所占比例最高,分别为29.58%和19.72%。
3 讨论
宫颈鳞癌和腺癌均是高危型HPV感染持续存在并危害机体的最终结果,可以由一种或多种HPV基因型对宫颈组织产生嗜鳞状上皮特征,进而导致上皮增生,引发宫颈组织发生瘤样病变,严重者甚至发生恶性病变。细胞核DNA正常复制过程中断、诱发染色改变和DNA损伤,是宫颈鳞癌和腺癌发生的基础。随着医疗科技水平不断升高,对HPV感染所造成的危害也逐渐明朗化。目前发现的HPV基因型共有120多种,双重和多重感染较一重感染和HPV感染阴性者发生各种良恶性肿瘤类型风险均显著升高,且不同HPV感染基因型诱导宿主发生宫颈鳞癌和宫颈腺癌病变风险各不相同。本研究中发现,宫颈鳞癌和宫颈腺癌HPV感染阳性率均较对照组显著升高,且宫颈鳞癌HPV感染阳性率远远高于宫颈腺癌,提示HPV感染在两种不同病理类型宫颈癌发生和发展中均具有显著作用,推测可能使得HPV感染阳性人群恶性肿瘤发生风险远远升高,且双重甚至多种HPV感染患者宫颈癌变风险更高。据国外研究资料报道,HPV感染后首先对上皮细胞造成微小损伤,进而侵入基底细胞中,并通过一系列相关作用和宫颈组织细胞表面的受体相结合,最终在细胞核内释放出相关病毒基因,进行DNA复制,同时诱发染色改变。由此可知,某一种特定的HPV感染基因型在不同机体中可能导致不同病理类型宫颈癌,而同一种病理类型宫颈癌也可能由一种或多种HPV感染基因型引发,故而判断宫颈癌HPV感染阳性患者主要基因型,分析宫颈鳞癌和宫颈腺癌分别于正常宫颈组织HPV感染基因型差异,以及二者间异同,对评估宫颈癌不同病理类型发生风险、合并有HPV感染的宫颈癌患者及时诊断治疗、随访以及预后判断均具有至关重要的作用和意义。HPV-16基因型在宫颈鳞癌和宫颈腺癌中所占比例均比较高,已成为公认的HPV感染患者发生宫颈癌高危基因型。据临床大样本数据调查结果显示,HPV-16基因型感染患者发生宫颈癌的比例约为1%,而一般低危型HPV感染患者发生宫颈癌的比例仅为0.1%,前者远高于后者,且由HPV感染高危基因型导致的宫颈癌患者在整个HPV感染导致宫颈癌患者中所占比例约为95%,可知高危型HPV感染无论在宫颈鳞癌还是宫颈腺癌的发生和进展过程中均占据至关重要的地位。同时也提示对于HPV感染阳性患者行基因型检测对评估宫颈癌发生风险具有极其重要作用。本研究结果显示,宫颈鳞癌和宫颈腺癌两组患者中,均以HPV-16基因型所占比例最高,提示HPV-16基因型感染患者可能具有较高宫颈癌发生风险。关于HPV-18感染对宫颈癌发生风险的影响国内外学者意见一致,均明确将其归为高危基因型。在一项包含有38个国家和地区的大样本回顾性调查研究中显示,8977例宫颈癌石蜡标本中,HPV感染基因型按照构成比例由高到低排列依次为HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33等,可知HPV-18感染对机体发生宫颈癌具有显著诱导和推动作用,其中HPV-18感染所占比例约为25%,而上述各种基因型所占比例总和约为94%,提示HPV-18基因型感染在各种高危型HPV感染中占据重要位置。本研究结果中,宫颈鳞癌和腺癌患者HPV-18基因型感染所占比例分别为19.81%和19.72%,较上述回顾性研究结果中稍微降低,推测其中原因为:(1)所有HPV基因型分布检测对象不同,上述研究HPV分型检测对象为细胞,但是本研究中所用检测对象为组织;(2)检测方法不同,上述回顾性调查研究中选用western blot检测方法,确定HPV基因型分布情况,但是本研究中采用PCR反应以及基因芯片技术进行检测。但是从两项研究结果中均可推测HPV-18基因型感染可能在宫颈鳞癌和腺癌发生和进展中参与并发挥促进作用。
综上所述,HPV感染基因型分布和宫颈鳞癌、腺癌发生均存在一定关联,其中HPV-16和HPV-18均是HPV感染高危基因型,应当将其作为宫颈癌筛查和发生风险评估的重要参考依据,并且应当将合并有双重或多重HPV感染的患者作为重点防控对象,以从根本上降低宫颈癌发生风险,改善妇女身心健康和生活质量。
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