前列腺癌组织中miR-21和PDCD4 mRNA的临床分析
文章导读:临床纳入我院2013年10月至2016年4月期间行手术治疗的26例前列腺癌患者,术中分别取患者前列腺癌组织及癌旁正常前列腺组织各26对。采用荧光定量PCR对所取组织进行检测,检测所取标本中miR-21以及PDCD4 mRNA表达情况,采用Western印迹检测前列腺癌及癌旁组织中PDCD4蛋白的表达水平,分析miR-21与PDCD4表达水平的关系。结果:前列腺癌中miR-21表达水平相对于癌旁组织来说更高(P<0.05);而PDCD4 mRNA表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。癌旁组织PDCD4蛋白表达灰度值比值明显高于前列腺癌(P<0.05)。前列腺癌miR-21与PDCD4 mRNA表达水平呈显著负相关(P<0.05);与PDCD4蛋白表达水平也呈明显负相关(P<0.05)。 |
前列腺癌是危害男性生殖健康的常见恶性肿瘤,尤其是在发达的西方国家较为常见。我国前列腺癌发病率虽然较低,但随着近年来人口老龄化的不断加剧,前列腺癌发病率有明显上升趋势,引起我国专家学者的关注。近年来分子层面的研究不断进展,人们更多致力于对肿瘤发生机制的研究。miRNA是一种内源性小分子RNA,具有调控基因表达水平的功能。研究显示,miRNA对肿瘤细胞的生长、分化凋亡等具有密切关系。目前miRNA中研究较多的为miR-21基因,miR-21在肿瘤细胞表达中存在异常现象,引起了专家学者的关注。程序性细胞死亡因子4(PDCD4)是近年来研究的抑癌基因,已被证实肿瘤细胞中PDCD4表达明显降低。因此本文为进一步研究前列腺癌的表达情况,对前列腺癌和癌旁组织的miR-21与PDCD4表达水平进行研究,探讨其发生机制。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究前列腺癌组织标本取自我院2013年10月至2016年4月期间收治的26例前列腺癌患者,所有患者经术中病理切片确诊为前列腺癌。患者均为男性,年龄48~79岁,平均年龄(59.6±4.1)岁。排除合并其他恶性肿瘤的患者、排除复发性前列腺癌患者等。本研究经我院医学伦理委员会批准通过。术中取前列腺癌组织及癌旁正常前列腺组织各26对,迅速置于液氮罐中,在零下80℃冰箱中保存备用。
1.2 方法
1.2.1 检测试剂
检测试剂包括无水乙醇、EDTA、SDS、生化试剂氯化钠等均由上海生工生物工程有限公司生产;相关引物由上海生工生物工程有限公司合成;氯仿、Trizol由美国Sigma公司生产;PCR试剂盒由Takara生物科技有限公司生产;使用由美国Abcam生物技术公司生产的抗人PDCD4单克隆抗体和β-actin多克隆抗体;北京康为实际生物科技有限公司生产的二抗;碧云天生物技术研究所生产的BCA蛋白浓度检测试剂盒。
1.2.2 检测方法
1.2.2.1 总RNA检测 取标本置于1.5mL EP管中,置入Trizol 1mL并研磨充分,静置10min后加入氯仿0.2mL,振荡摇匀15s,在37℃室温下孵育2min后放入离心机旋转离心,4000r/min,离心旋转15min。离心后取上层液体置入新的EP管中,置入异丙醇0.5mL,37℃室温下孵育10min后放入离心机旋转离心,4000r/min,离心旋转10min。离心后取沉淀物(RNA)并采用75%乙醇洗涤,检测RNA浓度和纯度。
1.2.2.2 Real-time PCR检测 采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒对标本中miR-21以及PDCD4 mRNA水平进行检测,miR-21引物上游序列:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3',miR-21引物下游序列:5'-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3'。PDCD4引物上游序列:5'-CCTGAATTAGCACTGGARACTCCR-3',PDCD4引物下游序列:5'-CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3'。
1.2.2.3 蛋白提取 标本中加入RIPA蛋白裂解液400μL在EP管中摇匀,再加入蛋白裂解液400μL振荡摇匀。将所得液体进行冰水浴并采用超声细胞粉碎机超声裂解5min,冰上静置30min,旋转离心10min,12000r/min,旋转温度调节至4℃,进行2次离心。采用BCA法定量蛋白并调整蛋白浓度至10μg/μL,使用零下80℃冰箱保存备用。
1.2.2.4 Western印迹检测 10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE,将蛋白转移至硝酸纤维素膜中(3h湿转,电流0.08A)。封闭液由PBST缓冲液配置,含1%BSA,30℃下封闭30min,后加入1∶1000的一抗孵育过夜,温度4℃。进行3次PBST洗涤,每次10min。后加入1∶10000的二抗孵育1h,HRP标记,温度37℃。PBST洗涤1次,采用化学发光法(ECL)显色,凝胶图像分析条带灰度值。
1.3 观察指标
观察前列腺癌组织和癌旁组织中miR-21、PDCD4 mRNA以及PDCD4蛋白的表达水平,分析前列腺癌组织中miR-21与PDCD4表达水平的关系。
1.4 统计学处理
采用SPSS18.0统计软件,计量资料用(x±s)表示,采用t检验,计数资料用百分比表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-21、PDCD4 mRNA表达与正常值的倍数情况
前列腺癌中miR-21表达水平相对于癌旁组织来说更高(P<0.05);而PDCD4 mRNA表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。
2.2 PDCD4蛋白表达灰度比值情况
癌旁组织PDCD4蛋白表达灰度值比值明显高于前列腺癌(P<0.05)。
2.3 前列腺癌miR-21与PDCD4表达水平的关系
前列腺癌miR-21与PDCD4 mRNA表达水平呈显著负相关(r=-0.702, P<0.05);与PDCD4蛋白表达水平也呈明显负相关(r=-0.644, P<0.05)。
3 讨论
前列腺癌是男性特有的生殖系统恶性肿瘤,对男性生殖系统有着巨大影响。(1)性生活不适:前列腺癌患者多有射精痛的感觉,因此影响患者性生活,严重患者甚至出现性欲减退等症状。(2)影响生育:由于前列腺是精子必经之路,因此在精子在经过前列腺时可能受到肿瘤细胞的破坏,从而导致精子畸形或少精,引起不育或胎儿畸形等。(3)影响机体功能:前列腺癌症状较多,直接影响患者生活质量和工作。(4)泌尿系统障碍:前列腺是泌尿系统的重要部分,前列腺癌患者容易对泌尿系统造成影响,导致泌尿系统障碍。目前临床上以手术为主要治疗方式,采用手术切除进行治疗,但根据多数报道显示,手术治疗存在易复发、易转移等问题,治愈率较低。随着生物分子学的不断进步,越来越多学者开始关注前列腺癌的发生机制和基因表达情况。研究表明,miRNA与肿瘤的发生发展有密切关系,不同miRNA在肿瘤发生发展中扮演不同角色。miRNA参与基因表达时,当调节的基因序列与被调节的mRNA一致时会导致mRNA降解。不同肿瘤miRNA表达谱不同,因此通过对miRNA的表达有助于寻找肿瘤标志物的治疗靶点。目前对miRNA的研究尚处于起步阶段,主要研究方向在于寻找肿瘤组织中表达异常的miRNA,从而建立特征性表达谱。目前对前列腺癌的研究中显示,前列腺癌组织中miR-21的表达水平异常,明显高于健康人,学者认为miR-21可能参与了前列腺癌的发生和发展。PDCD4是近年来发现的抑癌基因,部分学者研究发现,PDCD4的表达受到miR-21的调控,因此认为前列腺癌的miR-21与PDCD4表达水平与前列腺癌的发生发展密切相关。本文为进一步研究前列腺癌miR-21与PDCD4表达水平的关系,对前列腺癌及癌旁组织进行检测,结果发现,前列腺癌中miR-21表达水平相对于癌旁组织来说更高(P<0.05);而PDCD4 mRNA表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。癌旁组织PDCD4蛋白表达灰度值比值明显高于前列腺癌(P<0.05)。前列腺癌miR-21与PDCD4 mRNA表达水平呈显著负相关(P<0.05);与PDCD4蛋白表达水平也呈明显负相关(P<0.05)。结果提示,随着前列腺癌中miR-21表达水平异常升高,而PDCD4表达水平明显下降,可能是受到miR-21表达水平升高的调控而导致。综上所述,miR-21可能通过下调PDCD4表达水平从而参与前列腺癌的发病机制,从而引起前列腺癌的发生和发展。
来自《中国性科学》杂志 转载请注明出处