胰岛素样生长因子结合蛋白-3在原代培养的阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及定位
文章导读:原代培养大鼠CCSMCs并鉴定, RT-PCR检测IGFBP-3基因mRNA表达,用荧光免疫细胞化学法检测IGFBP-3在CCSMCs中的定位及蛋白表达。结果:RT-PCR能够检测到IGFBP-3 802bp特异性条带的表达,荧光免疫细胞化学法可见IGFBP-3蛋白表达并同时定位于CCSMCs胞质和胞核中。 |
胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein, IGFBPs)为调节蛋白的一种,可以与胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)结合,调节IGFs与其受体(insulin-like growth factor receptor, IGFR)的结合能力。 胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP-3)是目前已经发现的10种IGFBPs中的1种,IGFBP-3可以限制胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)进入靶细胞,达到调节IGF-1的功能的目的。我们前期研究发现,IGF-1基因和蛋白治疗可以改善糖尿病大鼠和老龄大鼠的勃起功能,IGF-1在阴茎勃起中起重要作用。由于IGFBP-3可以抑制IGF-1对勃起的促进作用,因此,抑制IGFBP-3的表达有可能是ED基因治疗的又一方向。最近我们研究发现,IGFBP-3在ED大鼠阴茎海绵体组织中表达明显增高,但IGFBP-3在原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus carvernosum smooth muscle cells, CCSMCs)中的表达是否增高,有待进一步的验证。因此,本研究探讨IGFBP-3在原代培养的CCSMCs中的表达,可深入探讨ED的可能机理,为寻找ED治疗可能的新的靶点提供依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
Trizol购自Invitrogen公司,Taq DNA Polymerase 购自MBI Fermentas公司,M-MLV Reverse Transcriptase购自Promega公司,Rabbit Anti-IGFBP-3单克隆抗体、Rat Anti-GAPDH抗体、α-actin抗体购自Sant Cruz公司,SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司,DMEM培养基、胰蛋白酶、I型胶原酶和胎牛血清等试剂购自Gibco公司,采用Primer Premer软件自行设计引物,引物交由杰特伟生物工程公司合成。BB5060型CO2培养箱由美国Heraeus公司提供,倒置相差显微镜由日本Olympus Tokyo公司提供,INM300型荧光共聚焦显微镜由德国LEICA公司提供。Mivnt图像分析系统由上海光学仪器研究所提供。成年SD大鼠(6月龄)3只(清洁级)由中山大学动物实验部提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
按照我们以前建立的方法,采用贴壁培养的方法进行阴茎海绵体平滑肌细胞的贴壁培养,当细胞长成单层或多层交错的致密细胞层时,传代培养(约10~14d);常规胰蛋白酶置消化传代。选择生长状态良好同时又处于对数生长期的CCSMCs培养于6孔板中玻片上。仔细观察细胞的成长情况,当细胞生长70%融合时,用预冷甲醛固定细胞约30min于玻片上,参照免疫组化试剂盒说明书操作行细胞鉴定,加入α-actin一抗,设立阴性对照,以PBS代替一抗。
1.2.2 RT-PCR检测 IGFBP-3 mRNA的表达按照我们建立的方法,采用Primer Premer5.0软件自行设计引物(Accession Number:M31837),引物序列如下:Sense: 5’- GGGCGTCCACATCCCAAAC -3’, Antisense: 5’-CCACAGTTCCCAAGTAGGTCAGG -3 ’。提取组织总RNA是通过Trizol法,按照甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的完整性;首先反转录成cDNA第一链,然后以第一链为模板,在以下条件下扩增:94℃ 10min,94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1min,30 cycles,94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 10min;扩增产物行0.7%琼脂糖电泳,共检测五组细胞。
1.2.3 荧光免疫细胞化学定位培养 于6孔板玻片上的状态良好的CCSMCs行荧光免疫细胞化学检测,重复三次,每次试验3个孔。无血清培养24h后,用丙酮和甲醇的混合液(1∶1)固定;用含5%BSA的PBS 37℃孵育1h阻断非特异性抗体的结合;加入1∶100稀释的两种单抗(Anti-IGFBP-3 和Anti-GAPDH),37℃温育1h;用再加入FITC偶联的两种二抗(1∶5000,分别标记红色和绿色荧光),37℃温育1h;加入Hoechest 32258染色,于室温避光染色30min,PBS洗涤后封片,用激光共聚焦显微镜观察。
2 结果
2.1 CCSMC的原代培养和鉴定
成功原代培养CCSMCs,光镜观察细胞生长状态良好。α-actin染色后在CCSMCs胞质中均可见到棕黄色的阳性表达,免疫组化细胞阳性细胞数达到达95%以上。
2.2 RT-PCR检测结果
RT-PCR成功从CCSMCs中扩增出802bp的目的基因条带。
2.3 IGFBP-3的定位结果
CCSMCs中荧光免疫细胞化学法定位可见IGFBP-3既表达位于细胞质,也表达于细胞核(绿色荧光),红色荧光为GAPDH,细胞核染色为蓝色。
3 讨论
IGFBP-3属于IGF系统家族,为六类IGFBPs超家族中的高亲和力类型。其基因定位于7p12214。IGFBP-3的C端保守序列含18个氨基酸,这种结构增加了IGFBP-3与IGFs的亲和力,当IGFBP-3的C端保守序列被水解切除后,IGFs即可释放,最终导致血管内皮细胞转运葡萄糖的能力加强。IGF系统是一个复杂的家族,有很多不同的功能。在细胞周期的影响方面,IGFs是细胞进入S期必需的要素之一,但是IGFBPs能够竞争性抑制IGFs与IGFR的结合,最终导致IGFs发挥正常的生理活性,限制了IGFs的活性左右。同时有研究显示,IGFBP-3 mRNA的上调表达,抑制了IGF促生长和促增殖的作用。IGFBP-3能够激活TGF-β受体以及抑制人肠道平滑肌细胞的增值;IGFBP-3能够通过限制IGF-1进入靶细胞而调节IGF-1的功能;IGFBP-3能够抑制IGF-1刺激的细胞增值。高水平表达的IGFBP-3能够减少IGF-1在阴茎海绵体组织中的作用。而IGF-1已经证实在阴茎勃起中扮演重要的角色,因此IGFBP-3可能在阴茎勃起中起到一定的负作用。通过以上理论可以推测,通过调节IGFBP-3的活性,可以达到间接调节IGF-1生物活性的目的,从而到达改善以及治疗ED的效果。Soh等最近采用糖尿病大鼠的动物模型,采用cDNA微阵列技术发现IGFBP-3表达增高,进一步用Northern Blot、Western blot和免疫组化证实IGFBP-3 mRNA和蛋白在链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导糖尿病后2周、4周、8周和12周阴茎海绵体组织中的表达均增高,IGFBP-3在阴茎内皮细胞和海绵体平滑肌细胞中表达均增高。作者认为IGFBP-3表达的增高不是ED发生的结果,而可能和糖尿病性ED的发生有关。Lin等研究了结扎阴部内动脉及其阴茎分支后大鼠阴茎海绵体的基因表达谱的变化,也发现结扎后较结扎前IGFBP-3基因表达增高。Shirai等采用VEGF阴茎海绵体注射治疗糖尿病大鼠,用RT-PCR和免疫组化检测IGF系统mRNA和蛋白的表达变化,发现IGFBP-3在未治疗前表达较高,治疗后IGFBP-3表达明显降低,而IGF-1和IGF-1R的表达没有明显变化,作者同时也认为IGFBP-3的增高可能和糖尿病ED的发生有关。Abdelbaky等用胰岛素治疗糖尿病大鼠并探索其可能的机理,发现在糖尿病大鼠阴茎海绵体和盆神经节(major pelvic ganglions, MPG) IGFBP-3的表达增高达10倍,采用胰岛素或者胰岛素加抗氧化剂能够明显减少海绵体组织和MPG中IGFBP-3的表达。我们最近的研究也证实在老龄大鼠阴茎海绵体组织中IGFBP-3 mRNA和蛋白的表达明显增高,提示IGFBP-3的高表达与老龄大鼠的ED发生有关。我们首次发现IGFBP-3在CCSMCs中表达,结合我们在阴茎组织中的研究,推测高表达的IGFBP-3可能会影响IGF-1生物活性,从而影响IGF-1介导的血管舒张,因此提示IGFBP-3的高表达与ED的发生可能有关,IGFBP-3可能是ED治疗的新的潜在的靶点。
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