中药苍柏湿毒清对小鼠阴道粘膜白介素12的影响
文章导读:取阴道解脲支原体培养阴性的Balb/c小鼠随机分为先干预后造模组(A1)、后造模对照组(B1)、先造模后干预组(A2)、先造模对照组(B2)、空白组(C)。A1予苍柏湿毒清水煎剂(1g生药/ml)灌胃0.2ml bid ;B1予生理盐水灌胃0.2ml bid,一周后,两组皮下注射雌二醇注射液0.2mg/周,共4周。第二次注射雌二醇后,阴道注射3代8型解脲支原体菌液20ul/日,共3次,1周后补种一次,造模成功后测量阴道粘膜IL-12浓度。A2及B2组先注射雌二醇0.2mg/周,共4周,第二注次射后阴道注射Uu菌液20ul/日,共3日,1周后补种一次。造模成功后进行中药水煎剂灌胃,0.2ml bid,对照组予生理盐水灌胃,0.2ml bid,共7日。干预后进行阴道粘膜白介素12浓度检测。结果IL-12浓度先灌药后造模组与模型组比,两组有显著性差异(P<0.05)。先干预与后干预两组比较,两组无统计学差异(P>0.05)。先造模后灌药组与其模型组比,两组有显著性差异(P<0.05),而两模型组之间比较,差异不显著(P>0.05)。干预组与空白组之间比较,均无统计学差异(P>0.05);同时,后造模对照组与空白组之间比较,无统计学差异(P>0.05),而先造模对照组与空白组间,有统计学差异(P<0.05)。 |
解脲支原体(U.urealyticum),因其能够分解尿素生长而得名,其生长代谢产物中含有氨,可使培养基PH上升。 解脲支原体可正常存在于人和动物的口腔、呼吸道以及泌尿生殖道中,是条件致病菌,其菌群在正常男性泌尿生殖道的寄生率约为25%,在女性其泌尿生殖道的寄生率约为0~80%,在患者粘膜局部坏境改变,或抵抗力降低时,可侵入并粘附与宿主胞膜表面受体上,释放毒素,以致病。既往流行病学研究显示,解脲支原体在女性泌尿生殖系统的定值率与年龄、种族、教育、收入、吸烟、性伴侣数量等因素相关。解脲支原体可引发的疾病主要有:非淋球菌性尿道炎(non-gonococcal urethritis, NGU)、盆腔炎(Pelvic inflammatory disease,PID)、宫颈炎(cervicitis)、阴道炎、输卵管炎、慢性前列腺炎(chronic prostatitis)、附睾炎(epididymitis)、不孕不育(sterility infertility)、反复流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)、早产(preterm labor)等,对新生儿而言,还可引起呼吸道疾病、脑膜炎等。现本病在临床上多以抗生素治疗为主。因病原体易于形成对抗生素的多重耐药,有些患者经过非正规治疗,经久不愈,反复发作。有研究显示,随时间推移,患者对常用抗生素的耐药率逐年升高,个别患者对常用抗生素的耐药率甚至达到了100%,这大大加重了治疗的难度。
在既往临床研究及体外抑菌实验中证实了苍柏湿毒清具有治疗气虚湿毒型解脲支原体感染的作用并进行了治疗机理的探讨。在动物实验方面,也证实了其可以降低小鼠阴道炎模型阴道Uu定植率。在本研究中将通过动物实验进一步探讨苍柏湿毒清治疗本病影响Uu定植率及改善临床症状的免疫学机制。
1 实验材料
1.1实验用器材
耗材:无菌手套、5ml无菌试管、精密PH试纸(6.0-8.0)、1000ul加样枪、100ul加样枪、无菌枪头、注射器、一次性隔离衣、手术器械等自备。
仪器:超净工作台,造鑫企业有限公司生产,型号:VCM-420;低温冷冻离心机,Thermo公司生产,型号:Fresco 17;酶标仪,Thermo公司生产,型号MULTISKAN MK3;显微镜,日本奥林巴斯公司生产,型号:BX51T-PHD-J11;切片机,德国徕卡公司生产,型号:RM2016;电子天平,瑞士METTER公司生产,型号:AE100;干燥箱,日本三洋公司生产,型号:MIR-153;低温冰箱,日本三洋公司生产,型号:MDF-382E;恒温水浴箱,江苏太仓公司生产,型号:DSHZ-300。
1.2 试剂
1.2.1 液体培养基
液体培养基使用珠海市银科医学工程有限公司生产的支原体分离鉴别管(培养法)。生产许可证编号:粤食药监械生产许20010311号。注册证书编号:粤食药监械(准)字2012第2400212号。执行标准:YZB/粤0039-2012。批号:1211141。
1.2.2 检测用试剂盒
测试用试剂盒购自北京睿基恒科技发展有限公司代购的美国安迪公司Quantikine小鼠IL-12 ELISA Kit试剂盒,规格:96T。
1.3 实验用药物
苯甲酸雌二醇注射液, 购自天津金耀氨基酸有限公司,规格:1ml:1mg,执行标准:《中国药典》2005版第二部,批准文号:国药准字H12020529,生产批号:9909281。
生理盐水,华润双鹤药业股份有限公司,规格:500ml:4.5g,批准文号:国药准字H11021192,生产批号:Y1212178W。
中药苍柏湿毒清组方:炒苍术10g、黄柏10g、柴胡10g、生黄芪10g、丹参15g、白扁豆10g、生薏苡仁30g、茯苓15g、马齿苋15g、苦参10g、马鞭草10g、虎杖10g、败酱草15g、白头翁10g、白花蛇舌草15g。上述药物来自北京中医药大学东方医院中药房,经生药鉴定合格。生药由本院制剂室浓缩成1ml药液中含1g生药的灭菌药液,分装于500ml无菌玻璃瓶中,密封,贴标签,于4℃冰箱储存备用。
1.4 实验动物
清洁级BALB /C 雌性小鼠100只,全部购自北京维通利华实验动物技术有限公司。鼠龄8周龄,体重16-18g,饲养于北京中医药大学东方医院实验中心动物实验室,清洁级。
1.5试验用菌株
解脲支原体血清8型菌株( ATCC27816), 由北京中原合聚公司代购自ATCC(美国模式培养物集存库)。复苏并传代2次后使用。
2 试验方法
实验分为实验1,和实验2,共需动物80只,按照实验过程中可能死亡率为20%,共购买BALB/c小鼠100只。
2.1 入组前阴道Uu培养
实验动物使用清洁级包装送入实验中心后,进行编号,并对所有实验动物进行阴道分泌物的Uu定植情况普查。培养结果为阴性的动物,则可纳入本实验。
2.2动物分组
使用CDAS2.0软件将入选实验的100只8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为A1组(实验1中药干预组),B1组(实验1生理盐水对照组),A2组(实验2中药干预组),B2组(实验2生理盐水对照组),C组(空白对照组)。
2.3 菌液复苏
将来自于ATCC的解脲支原体8型冻干菌株用复温后的液体培养基1ml充分溶解后,立即放入37℃温箱培养。大约24h后,培养基颜色由黄色澄清变为橘黄色澄清即提示复苏成功,立即转存于4℃冰箱终止传代。
使用精密PH试纸测菌液PH值在6.0-6.5之间,可用于传代。
将液体培养基放入37℃温箱中预热1小时。于超净工作台上,取12支试管,编号,置于试管架上,使用1000ul移液枪将每个试管均加入1.8ml预热过的液体培养基。
使用200ul微量移液器取复苏成功的原始菌液0.2ml,加入1号管内混匀后,从1号管中取0.2ml液体加入2号管,依次倍比稀释至第12只试管后,从12号试管取0.2ml液体丢弃。将全部试管放入37℃温箱孵育约24小时。
将变红的培养基取出测量PH值,PH在6.0-6.5之间者,如上法将菌株传至第三代,剩余菌液分别放入标号后的无菌冻存管内,用封口膜密封后于-80℃冰箱内冻存备用。
将复苏成功的3代菌液配制成105ccu /ml浓度的Uu菌液备用。
2.4 实验1
2.4.1 中药干预方法
将A1、B1组40只小鼠清洁级普通饲料饲养一周,使其适应动物房环境,观察小鼠毛色、精神、活动度、排泄、进食饮水情况。一周后,若小鼠情况全部正常,则进行下一步实验。
小鼠给药剂量设定为人类的6倍,按每公斤体重体表面积比值计算,假设小鼠体重为20g,每日应给药量为0.39g。
从第二周起,予A1组小鼠灌中药1周。按照人类服药方式每日两次给药,每次0.2ml,两次给药间隔6小时。从第二周起,每日予B2组小鼠生理盐水灌胃,每日两次,每次0.2ml,两次灌胃间隔6小时。
清洁级普通饲料饲养,每日观察A1、B1组小鼠神态、毛色、活动度、进食、进水情况,每周测量体重。
2.4.2 解脲支原体感染动物模型的建立
A1、B1组分别灌中药及生理盐水一周后,开始建立动物模型。
(1)于第3周起,予A1、B1组小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.2mg/只,选取腹壁、颈后、四肢近端等多处注射,保证药物吸收。每周1次,共注射4周。
(2)于第二次皮下注射雌二醇(即总实验进程的第4周)后,连续3日向A1组及B1组小鼠阴道注射Uu菌液20ul。
接种3次完成的1周后,再行阴道补种一次Uu菌液,剂量同前。
(3)清洁级普通饲料饲养,每2日观察小鼠毛色、饮食、饮水情况、精神、活动度、外阴情况,每周测量体重。
2.4.3 指标检测
造模完成后,对A1、B1组小鼠进行IL-12检测。小鼠脱颈处死后立即用手术器械,解剖会阴部,摘取完整的阴道组织,剔取内侧粘膜组织,冰冻保存,或立即使用美国安迪生物公司生产的小鼠IL-12 ELISA试剂盒进行检测,操作步骤按试剂盒说明书进行。
2.5 实验二
2.5.1 建立解脲支原体阴道感染模型
将A2、B2组40只小鼠清洁级普通饲料饲养一周,使适应环境。观察小鼠毛色、精神、活动度、进食饮水、排泄情况。
与第2周开始,每周用无菌注射器予A2、B2组40只小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.2ml。每2日观察小鼠神态、毛色、活动度、进食水情况,每周测定体重。
第二次注射雌二醇后,即总实验周期第3周,取复苏成功且配制好的第三代Uu菌液为40只小鼠进行阴道注射。使用100ul无菌加样枪,每只每次注射20ul,注射后使小鼠保持仰卧位静置数秒,使液体充分吸收。连续注射3日,最后一次注射后7日再行补种一次,剂量同前。造模完成后进行中药干预。
2.5.2 中药干预
各小鼠用药剂量如实验1。
A2组第6周起连续1周,每日予含生药1g/ml的中药浓缩液0.4ml,分两次灌胃,每次0.2ml,两次灌胃间隔6小时。
B2组第六周起,连续一周每日予生理盐水灌胃,每次0.2ml,每日两次,两次灌胃时间间隔6小时。
2.5.3 血清IL-2检测
中药干预完成后,对A2、B2小鼠进行阴道粘膜组织取样及局部IL-12浓度检测。检测方法步骤同实验1。
2.6 空白对照组
空白对照组小鼠清洁级普通饲料喂养,每2日更换垫料及饮用水,观察小鼠毛色、精神、活动度、进食饮水、外阴、阴道等情况,每周测量体重,不予其他处理。
第7周时,进行IL-12浓度的测定,方法步骤同上。