苍柏湿毒清对解脲支原体感染小鼠IL-2的影响
文章导读:采用苯甲酸雌二醇预处理,将解脲支原体血清4型菌液接种于BALB/c小鼠阴道,给予苍柏湿毒清低剂量、高剂量及其拆方预防性、治疗性干预,采用ELASA法检测小鼠血清IL-2水平。结果:苍柏湿毒清低剂量中药预防组提高血清IL-2水平高于其他各组(P<0.05);中药预防组、中药治疗组提高血清IL-2水平均高于模型组(P<0.05)。清热解毒组、健脾利湿组提高血清IL-2值高于正常组(P<0.05),但与模型组差异不显著(P>0.05)。 |
支原体(Mycoplasma),属柔膜体纲(Mollicutes),具有多形性、可塑性、可滤过性、易溶解性。柔膜体纲是目前所知能独立生活、自行繁殖的最小的生物。解脲支原体( Ureaplasma urealyticum, Uu),属支原体的一种,是泌尿生殖道感染的常见病原体之一,可引起非淋菌性尿道炎、前列腺炎、附睾炎、不育症、早产等病症。苍柏湿毒清治疗解脲支原体性尿道(宫颈)炎(脾虚湿毒证)临床疗效明确。本实验旨在观察应用苍柏湿毒清及其拆方对解脲支原体感染小鼠血清白介素2的影响。
1 实验材料
1.1 实验对象
BALB/c雌性小鼠,清洁级,鼠龄7周,体重(18±2g),购于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物许可证号:SCXK(京)2012-0001。对小鼠进行解脲支原体检测,将检测均为阴性的小鼠饲养于北京中医药大学东方医院实验中心动物实验室。
1.2 实验菌株
解脲支原体血清4型(ATCC27816),由北京中原合聚公司代购自ATCC(美国模式培养物集存库),复苏并传代配制成105CCU/mL的浓度备用。
1.3 试剂
苯甲酸雌二醇(规格1ml:1mg,国药准字:H12020529)购于天津金耀氨基酸有限公司。
解脲支原体液体培养基(粤食药监械(准)字2012第2400212号)购于珠海丽珠试剂有限公司。
小鼠白介素2(IL-2)ELISA试剂盒(规格:96T)生产于美国R&D公司。
1.4 中药组成及剂量
实验所需中药均购自北京中医药大学东方医院草药房。
苍柏湿毒清组由炒苍术10g、黄柏10g、生薏苡仁30g、生黄芪10g、苦参10g、土茯苓15g、茯苓15g、白扁豆10g、虎杖10g、白头翁10g、马齿苋15g、马鞭草10g、败酱草15g、丹参15g、柴胡10g、白花蛇舌草15g组成。
活血利湿组由丹参15g、败酱草15g、马鞭草10g、虎杖10g组成。
清热解毒组由黄柏10g、土茯苓15g、败酱草15g、白头翁10g、马齿苋15g、虎杖10g、马鞭草10g、苦参10g、柴胡10g、白花蛇舌草15g组成。
健脾利湿组由苍术10g、生薏苡仁30g、生黄芪10g、白扁豆10g、茯苓15g组成。
以上各组中药由北京中医药大学东方医院制剂室制备成浓缩药液。A组、D组、H组、I组、J组、K组用药量按成人6倍计算;B组、E组用药量按成人12倍计算。
2 实验方法
2.1 实验一
2.1.1 动物分组 将70只BALB/c小鼠按随机数字表随机分为A组(低剂量中药预防组)、B组(高剂量中药预防组)、C组(预防模型组)、D组(低剂量中药治疗组)、E组(高剂量中药治疗组)、F组(治疗模型组)、G组(空白组),每组10只。
G组只给予清洁级饲料喂养,不参与以下实验过程。
2.1.2 操作 A组、B组予中药灌胃,用药7d,2次/d,两次灌胃间隔6h。C组予清洁级饲料喂养7d。7d后对A组、B组、C组建立模型。模型建立采用雌二醇预处理法。
对D组、E组、F组BALB/c小鼠建立模型,造模完成后予D组、E组BALB/c小鼠中药灌胃7d,2次/d,两次灌胃间隔6小时。
2.2 实验二
2.2.1 动物分组 首先为60只BALB/c按随机数字表随机分成6组,即H组(全方组)、I组(活血利湿组)、J组(清热解毒组)、K组(健脾利湿组)、L组(模型组)、M组(空白组),每组均10只。
M组予清洁级饲料喂养,不进行模型建立及中药干预。
2.2.2 操作步骤 对H组、I组、J组、K组、L组BALB/c小鼠建立模型,造模成功后予H组、I组、J组、K组中药灌胃2次/d,连续7d。H组予全方组中药灌胃;I组予活血利湿组中药灌胃;J组予清热解毒组中药灌胃;K组予健脾利湿组中药灌胃。
2.2.3 样品检测 药物干预结束后2d,采用摘眼球取血法取1ml血液,离心后采用ELISA法对上清液中血IL-2进行定量检测。
2.3 数据处理
应用SPSS 20.0统计软件,P<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1 一般情况
BALB/c小鼠注射苯甲酸雌二醇注射液后出现不同程度的竖毛、蜷卧、进食减少;接种解脲支原体后小鼠外阴分泌物多、红肿,模型组小鼠有明显溃疡。空白组BALB/c小鼠明显较其它组小鼠活动活跃,毛色光滑,阴道无红肿溃疡。
3.2 实验一
实验过程中,A-5、A-6、B-10、E-7,4只小鼠死亡,考虑灌服中药时由于操作失误而死亡。B-5、D-5、E-1,3只小鼠死亡,考虑因外阴红肿、严重溃疡、感染致死。A-10、B-6、E-10,3只小鼠不明原因死亡。
采用LSD方法,D组、E组、G组组间差异无统计学意义均(P>0.05)。其他各组两两比较,P值<0.05,差异具有统计学意义。
A组与B组比较,P值为0.018,差异有统计学意义。
A组、B组分别与D组、E组、C组、F组、G组组间比较,P值均<0.0001,差异有统计学意义。
D组、E组分别与C组、F组组间比较,P值均<0.0001,差异有统计学意义。
3.3 实验二
实验过程中,L-9死亡,考虑注射雌二醇操作不当致死。M-1、M-4,2只小鼠不明原因死亡。I-2、L-6,2只小鼠死亡,考虑为UU严重感染所致。H-1、H-7、J-6、K-2,4只小鼠因灌胃操作不当呛咳死亡。
L组的血清IL-2与M组相比明显增高,P为0.016(P<0.05),差异有统计学意义;H组可明显提高BALB/c小鼠血清IL-2水平,与L组相比P为0.002(P<0.05),差异有统计学意义。J组与K组可提高BALB/c小鼠血IL-2水平,与M组相比P分别为0.003、0.007(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05),但与L组差异不大(P>0.05)。
4 结论
实验一中A组、B组经苍柏湿毒清干预后再建立动物模型,可提高血IL-2值,与C组、G组均有显著统计学差异(P<0.05)。提示苍柏湿毒清可提高小鼠血IL-2水平,在防UU感染中发挥重要作用。D组、E组成功建立UU感染的动物模型后经过苍柏湿毒清干预,与F组有显著统计学差异(P<0.05),与K组无显著统计学差异(P>0.05),提示苍柏湿毒清可提高UU感染小鼠血IL-2的低水平,在抗UU感染中发挥重要作用。
实验二中H组值明显高于L组、M组,提示苍柏湿毒清可提高BALB/c小鼠血IL-2水平。J、K组与M组有显著统计学差异(P<0.05),与L组无显著统计学差异(P>0.05),提示清热解毒组与健脾利湿组可提高正常小鼠血IL-2水平。
5 讨论
支原体感染引起的非淋菌性尿道炎、黏液脓性宫颈炎,多因房事不洁,感受秽浊之邪导致。男性患者表现为尿道口、尿道内刺痒不适、刺痛、烧灼感,可伴有尿急、尿痛等症状;尿道口可有浆液性或黏液脓性分泌物。女性患者表现为白带增多、外阴及阴道刺激瘙痒;宫颈充血、水肿,宫颈口可见黏液脓性分泌物。秽浊之邪夹杂湿邪自外阴侵入;足厥阴肝经循股阴,入毛中,过阴器。导致肝气郁滞,气郁化火。肝火横逆犯脾,导致脾气亏虚。久病耗气伤血,经络不通,致虚实夹杂。故李元文教授认为本病核心病机为脾气亏虚,湿热下注。
苍柏湿毒清具有清热解毒、健脾益气的功效。方中炒苍术、黄柏共为君药,清热解毒,健脾燥湿。生黄芪、生薏苡仁、白扁豆等为臣药,加强君药健脾益气,清热利湿之功。苦参、白花蛇舌草、马鞭草等佐以君药,加强清热解毒之功。久病入络,丹参为使要,具有活血祛瘀的功效。本方以益气健脾补其本虚,以清热解毒治其标实,从而达到攻补兼施,补泻并用,标本兼顾。
中药药敏实验表明,黄柏、白芷、地肤子具有明显的体外抑制Uu的药物作用。应用颗粒剂研究,苍柏湿毒清中黄柏抑菌效果最强,其次由高到低依次为白头翁、柴胡、土茯苓。苍术所含的芹烷二烯酮及苍术烯内酯I可抑制毛细管透过性亢进,且具有抗炎作用。实验表明口服苍术、黄柏,能明显减轻二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀。
对苍柏湿毒清治疗支原体性尿道(宫颈)炎进行临床研究,苍柏湿毒清颗粒组、苍柏湿毒清颗粒+左氧氟沙星组治疗后与治疗前比IL-2显著提高(P<0.05),苍柏湿毒清可能通过激活、调动人体的免疫功能,间接达到抑制、杀灭Uu的目的。IL-2是机体免疫调节网络中的核心物质,与其他细胞因子有协同和拮抗作用,共同完成机体免疫机能的平衡调节作用,可促进Th1、Th2、CTL和NK细胞等的活化和增殖。血清IL-2,由Th1分泌,可诱导Th0向Th1分化、促进Th1的进一步增殖。Th0为未受抗原刺激的初始CD4+T细胞,可分化为Th1、Th2、Th3等辅助T细胞。增殖的Th1可通过直接接触诱导CTL分化,杀伤胞内病原体感染细胞、肿瘤细胞等靶细胞。增殖活化的NK细胞通过表面活化性受体和抑制性受体对“自身”与“非己”进行识别,并直接杀伤感染的靶细胞。可见若能增加IL-2,则能扩大免疫效应,在抗感染中发挥作用。
苍柏湿毒清可能是通过提高血清IL-2在预防、治疗解脲支原体感染两方面发挥作用。在苍柏湿毒清拆方研究中发现清热解毒、健脾利湿两类中药可提高血清中IL-2水平,可能为苍柏湿毒清治疗解脲支原体感染类疾病的关键。
中药复方制剂具有多成分、多靶点等特点,其作用机理可能与调控机体免疫网络平衡有关,今后可以考虑结合动物模型分析更多的免疫因子,以期待探索中药作用于免疫系统的机理。
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