新型重组高效复合干扰素对卵巢癌细胞的生长抑制及促凋亡作用
文章导读: |
干扰素(interferon,IFN)是较早发现和应用的一类细胞因子,不仅具有抗病毒复制、抑制细胞分裂、诱导细胞分化、增强细胞吞噬功能等作用,还可以调节免疫反应,诱导细胞特定基因的表达,加强机体在抗肿瘤方面的免疫应答。其中以a-干扰素的抗肿瘤效果为优。
重组复合高效干扰素(recombinant super compound interferon,rSIFN-co)是一种具有自主知识产权的新型基因工程干扰素,它与干扰素的氨基酸序列一致,但由于采用了全新的纯化工艺,使rSIFN-co的蛋白质空间构象发生了改变,令其具有更强的抗病毒作用及极低副作用,但目前关于此类rSIFN-co的抗肿瘤作用的研究鲜有报道。本研究对体外培养的卵巢癌HO8019细胞使用新型重组高效复合干扰素,观察其对卵巢癌细胞的生长抑制以及促凋亡作用,并与常用的干扰素及化疗药物进行对比。
材料与方法
1 主要试剂及仪器
卵巢癌HO8019细胞株由哈尔滨医科大学肿瘤实验室惠赠;新型重组高效复合干扰素(rSIFN-co)由四川辉阳生命有限公司惠赠;同类型复合α干扰素(infergen)由美国安进公司生产;普通重组I型干扰素α-2b(IFNα-2b)购自哈药集团医药有限公司;顺铂注射液由云南生物谷灯盏花药业有限公司生产;MTT试剂为Sigma公司产品;二甲基亚砜为美国GΑYLORD生产企业产品;流式细胞仪;航新ZS-3板式酶标仪。
2 HO8019 细胞生长抑制试验
2.1 细胞培养与分组用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释药品,在96孔培养板中培养卵巢癌HO8019细胞。以培养液调定细胞数为1×105/ml制成单细胞悬液,在培养板各孔中加入100 ul细胞悬液。向培养板中分别加入rSIFN-co、复合α干扰素、IFNα-2b和顺铂,每种药物的浓度梯度为0.156ug/ml、0.625ug/ml、2.5ug/ml和10 ug/ml,并设置对照组,每个浓度设3个复孔。放置于37℃、5%CO2孵箱培养72小时。
2.2 MTT法检测细胞生长抑制率配制MTT试剂,使其浓度为5 mg/ml。培养板各孔分别加入10ul MTT液,轻微震荡使其混匀,放置于37℃、5%CO2孵箱中反应4小时后,见培养板孔底部出现蓝色结晶。弃去培养板中上清液,每孔加入100 ul二甲基亚砜,室温下待结晶溶解,在570 nm波长酶标仪读取OD值。
2.3 计算细胞生长抑制率细胞生长抑制率=(1-样品孔OD值/对照孔OD值)×100%。
3 HO8019 细胞凋亡试验
3.1 细胞培养与分组分13组在含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中培养卵巢癌HO8019细胞,第1组直接用培养液培养72小时,作为对照组;第2~4组rSIFN-co浓度分别为0.156ug/ml、0.625ug/ml、2.5ug/ml;第5~7组复合α干扰素浓度分别为0.156ug/ml、0.625ug/ml、2.5ug/ml;第8~1O组IFNα-2b浓度分别为0.156ug/ml、0.625ug/ml、2.5ug/ml;第11~13组顺铂浓度分别为0.156ug/ml、0.625ug/ml、2.5ug/ml。
3.2 流式细胞仪检测HO8019细胞凋亡率收集每组细胞至离心管中以1000r/min离心5分钟,弃去上清液,采用Αnnexin V/PI双染色法检测细胞凋亡。每样本细胞数约为1×106个,用孵育缓冲液洗1次,1000r/min离心5分钟,用100ul的标记液重悬细胞,室温下避光孵育15分钟,以1000r/min离心5分钟沉淀细胞,孵育缓冲液洗1次,加入荧光溶液在4℃下孵育20分钟,避光并不时震动,以流式细胞仪检测。
4 统计学处理
所有定量分析数据以±s表示,采用方差分析不同药物、不同浓度组之间的差异,应用SPSS 14.0软件包进行统计学分析。