应用重组腺相关病毒介导IGF-1基因修复糖尿病勃起功能障碍
文章导读:建立DMED动物模型,诱导糖尿病8周后,应用阿朴吗啡(APO, 80μg/kg)皮下注射进行阴茎勃起试验,筛选DMED大鼠模型。实验分组:A组为正常对照组,B组为模型未治疗组,C组为单纯转染rAAV2/1-IGF-1组,D组为控制血糖组,E组为转染rAAV2/1-IGF-1组+控制血糖组。应用免疫组化法比较IGF-1和NOS基因在各组中的表达水平,检测阴茎海绵体内压。结果:C、D、E组IGF-1和 nNOS阳性细胞百分比和IHS评分均高于B组,差异具有统计学意义(P<0.05),E组IGF-1和 nNOS阳性细胞百分比和IHS评分分别为(71.90±3.04)%、(4.16±0.15)分和(72.33±7.12)%、(4.32±0.28)分,均高于D组,差异具有统计学意义(P<0.05),C、D、E组阴茎阴茎海绵体内压均高于B组,差异具有统计学意义(P<0.05),E组阴茎阴茎海绵体内压为(230.69±8.34)mmHg,高于D组,差异具有统计学意义(P<0.05)。 |
勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是中老年男性的常见病、多发病,研究显示糖尿病引起神经病变是导致糖尿病ED(diabetic erectile dysfunction, DMED)的一个主要因素。现在越来越多的研究认为神经营养因子的特异性缺乏导致糖尿病性神经功能障碍,胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)作为一种促生长肽类激素,备受临床关注。本研究旨在研究重组腺相关病毒(rAAV2/1)介导IGF-1基因对DMED的修复作用及作用机制。
1 资料与方法
1.1 试验动物与试剂
广东省实验动物中心提供的8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠,体重230~360g。适应性喂养1周后用于试验。兔多克隆抗体nNOS购自武汉博士德公司,生产批号20140219。
1.2 动物处理与分组
制备重组腺相关病毒介导的IGF-1基因载体(rAAV-IGF-1),载体已由北京本元正阳公司构建成功。DMED动物模型的建立:应用65mg/kg链脲佐菌素(STZ品牌,sigma公司Alexis公司,批号:392-014-0613),溶入0.1M柠檬酸盐缓冲液,注射到大鼠的腹腔内,72h后测定血糖水平,当血浆血糖浓度>300mg/dL时,即被认为是糖尿病性大鼠。诱导糖尿病8周后,应用阿朴吗啡(APO,80μg/kg,东北制药集团公司沈阳第一制药厂,国药准字H2001335,生产批号20150123)皮下注射进行阴茎勃起试验,筛选DMED大鼠模型。实验分组:A组为正常对照组,B组为模型未治疗组,C组为单纯转染rAAV2/1-IGF-1组,按1.3×1011vg的滴度注射到大鼠阴茎海绵体,D组为控制血糖组,应用胰岛素进行治疗,6~8u/d,2次/d;E组为转染rAAV2/1-IGF-1组+控制血糖组。每组9只大鼠。
1.3 观察指标
基因治疗后第25d,海绵体注射1%FB来标记神经元,第28d取海绵体组织,每组各取6张切片,比较各组FB标记的神经元的数量,应用免疫组化法进行IGF-1和nNOS检测:从阴茎根部剪断阴茎,置入10%中性甲醛溶液固定,常规石蜡包埋切片。滴加兔多克隆抗体IGF-1和nNOS,在光学显微镜下观察染色结果,每切片随意计数5个高倍视野中阳性染色纤维数,每张切片在400倍的视野下随机选取50帧图像,MPIAS-2000型高清晰度彩色病理图像分析系统进行分析。阴茎海绵体内压的测定:基因治疗28d后,颈部正中切开行颈动脉插管连接换能器,持续监测平均动脉压(MAP),压力变化资料最终通过计算机收集并分析。
1.4 统计学处理
采用SPSS16.0进行统计分析,组间差异采用ANOVA和Post-hoc tests验定。
2 结果
2.1 各组阴茎组织IGF-1、nNOS阳性结果及免疫组化评分(IHS)
在各组阴茎组织中均有IGF-1的阳性染色,且主要在细胞胞核表达。nNOS阳性细胞主要在细胞胞浆表达。C、D、E组IGF-1和 nNOS阳性细胞百分比和IHS评分均高于B组,差异具有统计学意义(P<0.05),E组IGF-1和 nNOS阳性细胞百分比和IHS评分均高于D组,差异具有统计学意义(P<0.05),与A组相比,C、D、E组IGF-1和 nNOS阳性细胞百分比和IHS评分,差异均无统计学意义(P<0.05)。
2.2 各组阴茎阴茎海绵体内压结果比较
C、D、E组阴茎阴茎海绵体内压均高于B组,差异具有统计学意义(P<0.05),E组阴茎阴茎海绵体内压高于D组,差异具有统计学意义(P<0.05),C、D、E组阴茎阴茎海绵体内压与A组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
ED是一种多因素引起的综合征,包括神经血管病变、海绵体结构的改变、局部神经递质浓度改变、脂质代谢紊乱等。糖尿病引起勃起神经的病变会影响勃起的启动过程,导致ED的发生。阴茎勃起受中枢神经和周围神经的调控,脑、脊髓、脊神经根、阴部神经或海绵体神经损伤及病变均可导致反射弧传导通路的中断,引起勃起能力的减退或消失,复杂的神经网络难以应用传统的手段治疗DMED的神经功能障碍,但阴茎位置表浅,松弛状态时血流量低且存在内皮细胞腔隙的特点使阴茎具有基因治疗的良好靶器官的条件。本次研究结果显示,C、D、E组IGF-1和 nNOS阳性细胞百分比和IHS评分均高于B组,E组IGF-1和 nNOS阳性细胞百分比和IHS评分均高于D组,差异具有统计学意义(P<0.05),应用rAAV2/1介导IGF-1基因能够显著提升DMED大鼠的IGF-1和NOS表达。腺病毒相关病毒(AAV)是一种复制缺陷的微小单链DNA病毒,在高效转导、稳定表达以及安全性方面具有其他病毒载体所没有的优越性,可作为神经系统疾病转基因治疗的理想载体。rAAV -IGF-1是利用腺相关病毒在体内的高感染和可逆行转染的特性,在大鼠阴茎海绵体注射基因载体,整合IGF-1基因至支配阴茎的神经元,在局部表达IGF-1。IGF-1是由70个氨基酸组成的单链多肽,是一种强有力的有丝分裂原,具有调节代谢,促细胞增殖等广泛的生物学作用,能促进神经母细胞的增殖、存活和成熟,促进中枢神经系统中多极神经元的存活的发育,促进运动神经元前体细胞的分化。IGF-1与受体结合后,通过激活PI-3K-AKT和STAT途径刺激DNA、RNA的合成和细胞的增殖。应用病毒载体携带表达神经营养因子的基因,通过外周局部注射可以逆向特异性转染的方式,在局部表达目的基因,产生神经营养因子,而实现特异性治疗神经系统疾病的作用效果。发挥整体治疗作用。阴茎中主要存在神经型一氧化氮合酶(nNOS) 和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)两种类型的NOS,nNOS是阴茎海绵体中NO的主要来源,NO是参与阴茎勃起的最重要的神经递质。研究结果证实,经阴茎海绵体注射携带有目的基因IGF-1的rAAV2/1能够显著提升DMED大鼠NOS的表达,通过支配阴茎的神经轴索逆向轴浆运输,目的基因IGF-1可定向转染到支配阴茎的神经元,通过自分泌或旁分泌作用,在局部发挥神经营养作用,提升NOS水平,达到治疗糖尿病神经性ED的目的。本次研究结果可见,C、D、E组阴茎阴茎海绵体内压均高于B组,E组阴茎阴茎海绵体内压高于D组,差异具有统计学意义(P<0.05),应用rAAV2/1-IGF-1经阴茎海绵体注射可增加阴茎海绵体内压,对阴茎勃起功能障碍具有显著的修复作用。将IGF-1基因特异性导入支配阴茎的神经元,能特异地作用于靶器官,在局部发挥其特有的生物学效应,实现特异性治疗神经系统疾病的作用效果。应用rAAV2/1介导IGF-1基因对DMED大鼠可避免外周静脉注射神经营养因子治疗的糖尿病神经病变不确切性和药物的不良反应,为治疗无效的ED病例开辟一新的治疗途径,也可为糖尿病其他神经病变的治疗提供一个新的思路。
综上所述,应用rAAV2/1介导IGF-1基因对DMED大鼠能够显著提升IGF-1和NOS表达,增加阴茎海绵体内压,对阴茎勃起功能障碍具有显著的修复作用。
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