宫颈癌标本中HPV16的E6、E7和LCR的变异研究
文章导读:随机选取我院病理实验室于2015年1月至2016年1月期间留存的HPV16阳性宫颈癌标本100例为研究对象,分别采用PCR技术进行E6、E7和LCR片段的扩增处理,并采用DNA序列进行PCR扩增产物的序列测定,分析E6、E7和LCR的变异表现。结果:E6基因中最常见变异为T350G(67.27%),E7基因中最常见变异为T789C(72.67%),LCR最常见变异为G7521A(90.90%),LCR区中出现G7799A、A7636C、C13T、C7678T新变异,E7区高度保守,YY1转录因子结合点是LCR变异的主要集中点。 |
宫颈癌属于一种恶性肿瘤,在妇产科极为常见,宫颈属于人体的一个解剖部位,极为特殊,近年来,宫颈发生病变的几率呈现逐年上升的趋势,宫颈癌的发生率居于女性恶性肿瘤的第二位,仅次于乳腺癌。在宫颈癌的防治中,对宫颈癌前病变进行准确高效的筛查具有极为重要的临床意义。近年来,大量的临床研究结果表明,高危型HPV对宫颈癌疾病的发生发展具有重要的影响作用,HPV在人和动物的基因组表现中比较保守,基因组最大为8200bp,最小基因组约7400bp。HPV属于环状双链DNA病毒,且无包膜。临床研究结果显示,HPV变异将对病毒组装、免疫反应以及转录调节等产生一定影响,本组研究中采用DNA测序的方式研究宫颈癌病变与病理分级的关系。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组宫颈癌标本均来自我院肿瘤科病理实验室,随机选取100例标本,所选标本均经标准HPV分型,其中55份标本为HPV16阳性。新鲜肿瘤标本采用PBS法收集,并在-70℃保存,所有患者均对本研究知情,并自愿参与本研究。该研究已提交医院伦理委员会审批并获准。
1.2 方法
宫颈癌标本中的高分子量基因组DNA采用酚-氯仿抽提方法进行分离处理,采用通用引物引物和特异性引物进行HPV检测和高危型HPV16和HPV18分型的鉴定,内部对照以β-球蛋白基因的扩增为准。反应条件:引物5pmol,总体积25μL,100ngDNA,1.5mM MgCl2,10mM Tris-Cl(pH8.4),50mM KCl,dGTP 12.5μM、dCTP 12.5μM、dATP 12.5μM、dTTP 12.5μM,Taq DNA聚合酶0.5U。反应步骤:于95℃下,经预变性处理5min,并延伸30s;55℃下退火处理30s,并在72℃下延伸30s,该反应处理共进行30个循环。E6的位置在83~559,长度477bp,E7位置在562~858,长度为296bp,LCR位置在7438~7459、119~149,长度为617bp。引物序列如下:正义链:E65’-GAA GGT TAT AGC AAA AGA ACC TAG C-3’E75’-CCA TAT TAA GCG GAA TCG TAG AGC AG-3’LCR5’-CCA TAT TGT AGC ACC TAT TAA GCA-3’反义链:E65’-ACC ATA AGT ATC ATG TGG AGC ACG CT-3’E75’-TTT AGC CAA GAG TAA CCG TAC ATC CAT-3’LCR5’-AGG TCT AAT AGT AGC TAA TCG CCA ATT TG-3’
1.3 E6、E7及LCR变异分析与鉴定
变异分析:采用DNA测序仪测定经PCR扩增后的序列,数据收集采用ABIPrism310软件进行收集,同时采用Version3.4.1软件进行数据测序分析。为了确保PCR扩增产物的测序结果的准确性,可以采用反向测序进行再次验证。变异体鉴定:E6、E7及LCR变异体采用原型HPV-16R进行数据的鉴定,变异体包括European(E)、Asian American(AA)、North American(NA)、African1(Af-1)、African2(Af-2)、Asian(As)。
1.4 统计学分析
采用SPSS18.0统计学软件进行数据处理。
2 结果
2.1 宫颈癌HPV分型结果
采用HPV通用引物检测,100份宫颈癌标本中均能检测到HPV,其中55份(55.0%)标本感染HPV16,30份(30.0%)标本感染HPV58,15份(15.0%)标本感染HPV52。
2.2HPV16变异的鉴定
55份HPV16阳性标本中E谱系占65.45%(36/55),A谱系占25.45(14/55)。所选宫颈癌标本中尚未检测到AA、NA、Af-1、Af-1谱系。其中E原型在HPV16E谱系中占54.55%,E变异体占45.45%。
2.3 基因序列的变异结果
E6核苷酸变异率在HPV阳性标本中占67.27%(37/55),氨基酸变异为50.91%(28/55)。其中G90A、T241A、A130C为E6核苷酸变异位点的3个沉默突变。第178核苷酸为表现较为频繁的序列变异位点,包括T178A、T178G。而G94A和T350G是其他较为常见的突变位点。E7基因序列变异率为72.72%(40/55),其中位点A647G和A645C是错义突变,沉默突变位点为G666A、T760C、T843C、T843C;氨基酸变异率为40.0%(22/55),较为常见的变异为T846C(72.72%)、T789A(36.37%)、A647(32.73%),最常见的氨基酸变异为N29S(36.37%)。LCR基因序列变异率为58.18%(32/55),最常见的变异G7521A(90.90%)。
3 讨论
宫颈癌筛查一直是临床研究的热点问题,随着人们生活水平的提升,广大妇女对宫颈癌疾病的认识和预防知识也不断增加。宫颈癌是一种比较常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率也在不断上升。近年来宫颈癌发病呈低年龄化趋势发展,有很多没有生育患者出现。流行病学调查研究显示,宫颈癌、乳腺癌发病率呈现逐渐上升的趋势,目前关于宫颈癌发病机制尚不清晰,多认为与饮食、家族病史等有关。由于患者的临床症状缺乏典型性,早期诊断率较低,早期诊断和治疗能够改善预后,对宫颈癌筛查工作有重要价值。宫颈癌是可以预防和及时治疗的,宫颈癌从病变前到癌变是一个相对漫长的过程,大约需要10年的时间,在这一阶段如果及时发现并采取相应治疗措施,是可以对癌症进行早期预防的。 相关临床研究结果显示,不同HPV变异体的致瘤性表现存在一定差异,且不同地区的调查研究数据具有差别,这与人群中HLA等位基因的分布有密切关联。宫颈癌350G E6的变异频率增加导致L83V位亮氨酸发生改变,亮氨酸变成缬氨酸与宫颈损伤相关。由于宫颈癌HPV16变异体具有引发不同生物化学效应和致瘤潜能的作用,宫颈癌HPV16中E7也存在明显的核苷酸变异,这与以往关于LCR核苷酸序列以及HPV16 E6、E7变异的相关报道一致。LCR是不同病毒细胞形成基因转录的重要结合位点,能够起到调节HPV基因转录的作用,同时具有激活P97启动子活性的作用,同时能够在一定程度上抑制活动,尤其是HPV16中E6和E7原癌基因的表达。本组研究结果显示,LCR核苷酸的变异率较高,其次为E6和E7,这与以往的相关报道相似,且LCR作为病毒基因转录调控的主要位点,其基因变异与病变生物学特征及临床病理特征相关。此外,由于Oct-1是病毒基因转录的重要组成部分,Oct-1结合位点突变将影响HPV的进一步表达,所以在HPV16 LCR的基因表达中可以发现,Oct-1结合位点突变频率较低,癌变基因E6和E7的变异能够在一定程度上导致编码的蛋白生物学功能发生改变,进而影响HPV感染的病变进程。
综上所述,HPV16型内变异对宫颈癌病变的进展具有重要的生物学意义,通过深入分析宫颈癌标本HPV16中E6、E7及LCR变异的特点,可以为临床上HPV早期诊断提可靠依据,同时为宫颈癌疫苗开发与设计提供相关参考依据,具有积极的临床意义。
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